2018 Fiscal Year Research-status Report
造血におけるゼブラフィッシュDnmt3aa標的ゲノム領域と領域特異化因子の解明
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18K06185
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
菊池 裕 広島大学, 理学研究科, 教授 (20286438)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | dnmt3a / DNAメチル化 / ゼブラフィッシュ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
de novo DNAメチル基転移酵素Dnmt3aは、ゲノムDNAのメチル化修飾を介して遺伝子発現を制御している。私達は、哺乳類Dnmt3aの相同遺伝子であるゼブラフィッシュdnmt3aa遺伝子の母性胚性ノックアウト変異体（MZdnmt3aa-/-）を作製した結果、血管芽細胞（血液と血管内皮細胞の共通の前駆体細胞）は形成されるが、血管内皮細胞の低形成・血液細胞（一次・二次造血）の大幅な減少が観察された。本研究課題では、MZdnmt3aa-/-胚を用いた網羅的遺伝子発現解析・全ゲノムバイサルファイトシークエンス解析（WGBS）・クロマチン免疫沈降解析（ChIP）等により、Dnmt3aaの直接の標的であるゲノム領域の解明と領域特異性を決める因子の同定を研究目的としている。
本年度は、組織・器官形成がほぼ完了した2日目ゼブラフィッシュ幼生からゲノムを抽出し、WGBSによりメチル化解析を行った。野生体と比較して変異体特異的にメチル化が減少したゲノム領域（differentially methylated region: DMR、2kbp以上の領域に10個以上の異なるメチル化シトシンが含まれる領域）を探索した結果、ゲノム全体で23ケ所見出された。このDMRの中で6ケ所は、哺乳類ゲノム（ヒト・マウス）においても塩基配列が高度に保存されており、その配列の中には複数の転写因子認識配列が含まれていた。また、6ケ所のDMRのうち、5ケ所はガン関連遺伝子のゲノム領域である事が明らかになった。
以上の結果より、本研究ではWGBSによりゼブラフィッシュdnmt3aa特異的メチル化ゲノム領域を特定する事に成功し、その一部は哺乳類ゲノム（ヒト・マウス）においても高く保存されている事、ガン関連遺伝子のゲノム領域である事を見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は、「MZdnmt3aa-/-胚における造血の解析」と「MZdnmt3aa-/-変異体におけるメチル化減少領域の特定」に関して解析を行い、以下の様な結果を得た。
１．MZdnmt3aa-/-胚における造血の解析
MZdnmt3aa-/-胚の造血に関しては、全く血液が観察されない胚から野生胚と変わらない胚まで、表現型に大きな違いが見られた。現在、この様な表現型の違い引き起こす原因を探るため、各発生時期における血球マーカー遺伝子の発現に関して、継続して解析を行っている段階である。
２．MZdnmt3aa-/-変異体におけるメチル化減少領域の特定
WGBSにより、全ゲノムにおけるメチル化解析を行った結果、MZdnmt3aa-/-変異体において、DNAメチル化が野生体と比較して有意に減少したゲノム領域（Differentially Methylated Region, DMR: 2kbp）は、23カ所しか無いことが明らかになった。更に、この23カ所に関して、哺乳類（ヒト・マウス）ゲノムの塩基配列との相同性比較を行った結果、6カ所のDMRは哺乳類ゲノムと高い相同性を示すと共に、相同配列の中には様々な転写因子のコンセンサス配列が見出された。これら6ケ所のゲノム領域の中で、5ケ所は遺伝子領域であり、1ケ所はノンコーディングRNAの領域であった。5ケ所の遺伝子領域は、kcnip1: potassium voltage-gated channel interacting protein 1、gucy2e:guanylate cyclase 2E、fktn: fukutin、kcnh7: potassium voltage-gated channel subfamily H member 7、hmx1: H6 homeobox 1であり、全てがん細胞関連遺伝子であった。
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| Strategy for Future Research Activity |
来年度は、MZdnmt3aa-/-変異体における表現型やメチル化減少領域（DMR）を更に詳細に明らかにするため、以下の実験を推進する予定である。
１．MZdnmt3aa-/-胚における表現型の解析：MZdnmt3aa-/-胚において観察された、造血の表現型の違いを明らかにするため、各発生時期における血球マーカー遺伝子の発現を詳細に調べる。更に、MZdnmt3aa-/-胚の詳細な表現型解析を行った結果、新たに骨格筋形成に異常がある事を見出した。骨格筋形成のどの様な過程に異常が生じているのかを明らかにするため、詳細なマーカー遺伝子発現の解析を行う予定である。
２．MZdnmt3aa-/-変異体におけるDMRの解析：6ケ所のDMRに関して、受精直後～2日目幼生におけるメチル化の変化をバイサルファイトシークエンスにより調べ、細胞増殖・分化過程におけるメチル化変動の詳細を明らかにする。更に、ヒトのDNMT3A KO造血幹細胞とのデータ比較を行うため、MZdnmt3aa-/-変異体の腎臓（ゼブラフィッシュにおける二次造血器官）からゲノムを単離し、6ケ所のDMRのメチル化状態を調べる。
３．ヒトDNMT3A遺伝子の過剰発現によるメチル化のレスキュー実験：MZdnmt3aa-/-変異体においてメチル化が減少した6か所のDMR領域は、哺乳類（ヒト・マウス）ゲノムの塩基配列と高い相同性を示し、様々な転写因子のコンセンサス配列が見出された。以上の結果より、ゼブラフィッシュとヒトにおいて、6か所のDMR領域は同様のメカニズムによりメチル化が制御されている可能性が予想される。そこで、ヒトDNMT3A mRNAをMZdnmt3aa-/-胚で過剰発現させ、メチル化の変化を調べる。このレスキュー実験により、ヒト―ゼブラフィッシュ間で共通のメチル化システムを明らかにする事が出来ると考えている。
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[Journal Article] Anticancer polymers designed for killing dormant prostate cancer cells.2019
Author(s)
Takahashi, T., Yumoto, K., Yasuhara, K., Enrico T. Nadres, T.E., Kikuchi, Y., Taichman, R.S., and Kuroda, K.
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 9
Pages: 1096
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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