ゲノム改変細胞を用いたコアヒストンの生理機能解析

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K06186
• Research Institution: University of Miyazaki
• Principal Investigator: 高見 恭成 宮崎大学, 医学部, 准教授 (80236356)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: ヒストン / クロマチン / エピジェネティクス / エピゲノム

Outline of Annual Research Achievements

コアヒストン（H2A, H2B, H3, H4)はクロマチン構造の根幹をなす分子であり、これら分子の部位特異的なアセチル化、メ チル化等の修飾が様々なクロマチン介在反応に与える影響は明らかではあるが、こうしたの知見は主として修飾酵素のノックアウト・ダウン実験から得られた間接的なものである。それは高等動物では、酵母などの単細胞生物とは違って、コアヒストン分子やその化学修飾の有す る生理機能を遺伝学的 にin vivoで直接検証できる実験系が存在しないためである。これは動物種の個々のヒストン 遺伝子が数十~数百コピーからなる多重遺 伝子であり、複数の染色体に局在しているため、 個々の全コアヒストン遺伝子を任意の変異ヒストンと置換することは極めて困難であると考えられてきたため である。。本研究目的は、これまで多重遺伝子であるため遺伝学的解析は困難とされてきたコア ヒストンの生理機能をニワトリ B 細胞株である DT40 を利用し たゲノム改変細胞を用いて明らかにすることである。ニワトリDT40細胞の全Canonicalヒストン遺伝子群(各H1,H2A, H2B, H3, H4遺伝子が5-10コピー/haploid) が、一番染色体上の一 カ所(約100kb内)に存在する利点を生かし、conditionalに本ローカスを一括して除去可能な改変細胞株の樹立を試みた。本年度はヒストンゲノム除去システムとして、今回Cre-loxシ ステムを用いてヒスト ン除去できるノックインベクターを作製し、DT40細胞を用いて、これらベクターの効果について検討している。また、 各 ヒストン遺伝子(内因性の制御領域を含む)を1コピーずつ含む発現コンストラクトを作製 し、このconditional細胞の特定ゲノム部位に挿入可能なシステムを構築することを試みた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初計画していたノックインベクターの構成に問題が生じたことと、研究実施体制を整えるのに時間を要してしまい、計画通りに進めることができなかったた め。

Strategy for Future Research Activity

1.引き続き細胞レベルでヒストン制御システムの開発を行う。当初候補に挙げていたノックアウトベクターの構成の問題で十分な効果が得られない可能性が出 てきたため、候補の追加やベクター構成の変更等も視野に入れて検討する。
2.構築した統合的ヒストンゲノム制御システムを導入した遺伝子改変細胞を作製する。
3. CRISPR-Cas9を用いてヒト細胞での上記システムの適用を行うことを検討している。