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2018 Fiscal Year Research-status Report

抗体のRNA高次構造特異的な認識を利用したエピトランスクリプトーム解析技術の開発

Research Project

Project/Area Number 18K06192
Research InstitutionNational Institute of Advanced Industrial Science and Technology

Principal Investigator

吉岡 恭子  国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (50358321)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 栗田 僚二  国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究グループ長 (50415676)
Project Period (FY) 2018-04-01 – 2021-03-31
KeywordsRNAエピジェネティクス / N6メチルアデノシン / イムノアッセイ / 表面プラズモン共鳴法 / 大腸菌RNA
Outline of Annual Research Achievements

修飾核酸塩基を認識する抗体が核酸二重鎖の高次構造、特にバルジ構造内の塩基に特異的に結合することを利用し、大腸菌rRNA配列中の修飾塩基を測定した。バルジ構造内にある塩基は自由に回転でき、抗体に認識されやすいと考えられる。
まずは、細菌の抗生物質耐性機構に関与することが知られている23S rRNA2058位のN6-メチルアデノシンを検出ターゲットとした。ターゲット塩基の位置でバルジ構造を形成するDNA配列をプローブとした。合成オリゴRNA配列中の特定N6メチルアデノシンを、表面プラズモン共鳴法(SPR)およびマイクロタイタープレートを用いたイムノアッセイ法により測定した結果、検出限界濃度は0.5 nM、バルジ構造にあるN6-メチルアデノシンへの抗体結合は、KD=~10-8 (M)とアフィニティは十分高いことが解った。
大腸菌より精製したRNAの特定N6-メチルアデノシン(23S rRNA2030位、野生株でメチル化されているアデノシン)も同様に、RNA制限酵素による断片化処理とバルジ形成DNAプローブとのハイブリッド鎖のイムノアッセイ測定により配列選択的に検出できることを示した。大腸菌RNA実試料は、最少で5 ngあれば増幅なしでも検出可能であることも示した。
本課題で開発したイムノアッセイ法は、RNAの特定修飾塩基を、DNAへの逆転写やPCR増幅させることなく、配列選択的に簡易検出できる方法として意義がある。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

初年度は、研究実施計画に従って研究は順調に進み、得られた研究成果は、学会発表(日本分析化学会年会)と論文発表を行った。

Strategy for Future Research Activity

今後は、本課題初年度で開発した修飾核酸塩基イムノアッセイ法を利用した小型測定デバイスの開発に取り組む。大腸菌RNAアデノシン塩基のN6メチル化計測を、開発した小型測定デバイスで行う。メチル化酵素欠損株や突然変異による抗生物質耐性株を取得し、RNAのアデノシンのメチル化状態の簡易計測を検討する。動物培養細胞RNA(rRNA、mRNA、マイクロRNA等)のメチル化計測へも測定対象を拡げる。

Causes of Carryover

初年度、イムノアッセイ用装置の導入を計画していたが、研究室既有の装置を使用することで導入の必要がなくなった。2019年度以降は、新規測定デバイスのチップ作成費等(消耗品)に使用する予定である。また、イムノアッセイ用既有装置の老朽化があるので、更新する可能性もある。

  • Research Products

    (8 results)

All 2018

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (6 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results)

  • [Journal Article] Immobilization of DNA with nitrogen mustard-biotin conjugate for global epigenetic analysis2018

    • Author(s)
      小島直、須田友美、栗之丸隆章、栗田僚二
    • Journal Title

      Analytica Chimica Acta

      Volume: 1043 Pages: 107-114

    • DOI

      10.1016/j.aca.2018.09.008

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] N6-Methylation Assessment in Escherichia coli 23S rRNA Utilizing a Bulge Loop in an RNA-DNA Hybrid2018

    • Author(s)
      吉岡恭子、栗田僚二
    • Journal Title

      Analytical Chemistry

      Volume: 90 Pages: 7578-7582

    • DOI

      10.1021/acs.analchem.8b01223

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 抗体のバルジ構造特異的な認識を利用したrRNA修飾塩基検出法2018

    • Author(s)
      吉岡恭子、栗田僚二
    • Organizer
      日本分析化学会第67年会
  • [Presentation] Detection of Cytosine Variants of DNA Using Surface Plasmon Resonance-Based Immunoassay2018

    • Author(s)
      栗之丸隆章、小島直、栗田僚二
    • Organizer
      第45回国際核酸化学シンポジウム日本核酸化学会第2回年会
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] エピゲノム修飾の包括的評価にむけたSPRイムノアッセイの開発2018

    • Author(s)
      栗之丸隆章、小島直、栗田僚二
    • Organizer
      第12回バイオ関連化学シンポジウム
  • [Presentation] 核酸固定化試薬の開発とメチル化シトシンイムノアッセイへの応用2018

    • Author(s)
      小島直、栗之丸隆章、須田友美、栗田僚二
    • Organizer
      日本核酸医薬学会第4回年会
  • [Presentation] シトシンバリアントの一括計測に向けたSPRイムノアッセイの開発2018

    • Author(s)
      栗之丸隆章、小島直、栗田僚二
    • Organizer
      化学とマイクロ・ナノシステム学会第37回研究会
  • [Presentation] Immobilization of Genomic DNA with Bifunctional Linker Molecules for 5-Methylcytosine Immunoassay2018

    • Author(s)
      小島直、栗之丸隆章、須田友美、栗田僚二
    • Organizer
      9th Annual symposium of the Indian Scientists Association in Japan
    • Int'l Joint Research

URL: 

Published: 2019-12-27  

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