ゲノム合成の基盤技術を自然界でのDNA水平伝播現象をもとに構築する

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K06196
• Research Institution: Tokyo Institute of Technology
• Principal Investigator: 金子 真也 東京工業大学, 生命理工学院, 助教 (10399694)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: ゲノム合成 / コンティグDNA / 枯草菌 / 応用微生物 / 形質転換 / 核酸 / ゲノム / バイオテクノロジー

Outline of Annual Research Achievements

当該年度は「枯草菌の通常の形質転換法(自然形質転換)では複数のDNA断片の導入及び連結は不可能である」ことの改善策にとして、プロトプラスト法による形質転換法に取り組んだ。細胞膜を人為的に加工し、DNA断片を直接取り込みやすくする方法で、通常の形質転換法より多くのDNA断片を端から端まで細胞中に導入できる。導入されたDNA断片の相同組み換え効率を上げるために、枯草菌のコンピテントセルをそのままプロトプラスト化する方法を検討した。枯草菌は通常培養下では相同組み換えに必要なRecA酵素がほとんど発現していないが、コンピテントセル作成用の貧栄養培地ではRecAが誘導発現されることが知られており、GFP遺伝子と薬剤耐性マーカーを有する枯草菌用のプラスミドを用いて培養時間や再生培地の条件などを探索した。また同プラスミドをPCRによって両端が500bp程オーバーラップするように2断片に分割して増幅し、プロトプラスト形質転換を行った結果、これら2断片が繋がったプラスミドを保持する薬剤耐性コロニーが得られ、UV照射下で緑に光ることが確認できた。これはコンティグDNA断片が枯草菌細胞中で連結できることを示すものであり、目的達成のための重要な一歩である。動物培養細胞への導入法については、溶菌法の条件検討を行いつつ、広域宿主で接合伝達可能なRP4系の接合伝達システムの検討を開始した。大腸菌をドナー宿主とするpUB307プラスミドを用いて、真核細胞への接合伝達が可能か調べるため、酵母の複製起点やゲノム相同領域を導入したプラスミドの構築を行った。約55kbの環状プラスミドとしてサイズが非常に大きいためプラスミド構築に苦戦したものの、構築できたプラスミドを用いて接合伝達の条件検討を行い、大腸菌から酵母への長鎖DNA導入が可能であることが確認できた。今後、動物細胞への導入が可能か検討する予定。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当該年度は、「コンティグクローン連結法」の問題点の解決法としてプロトプラスト法による形質転換法に取り組んだ。相同組み換えの効率を上げるためにRecAが発現誘導されている枯草菌のコンピテントセルを用いたプロトプラスト形質転換法を考案し、コンティグDNA断片2つを細胞中で連結させることに成功した。これは「コンティグクローン連結法」を実現するための重要な結果であり、昨年度直面した大きな問題点を克服する必要不可欠な解決策である。当初発現誘導型のRecAを持つ枯草菌株構築も考案していたが、培養条件、発現誘導のタイミングやプロトプラストからの再生方法が煩雑になると見込まれていたのに対し、枯草菌本来のRecA発現誘導を利用することで効率良く目的のコンティグクローン連結の為の形質転換が行えることが実証できた。高効率で安定したプロトプラスト細胞構築法や形質転換効率の改善について、条件検討の余地は残っているものの、当該年度実施予定であった問題点の改善、効率化に向けた研究を実施することができた。また「動物培養細胞への導入法」については、溶菌法による動物細胞への導入法について条件検討中であるが、今年度はさらに当初の予定通り、接合伝達法を用いた導入法についての検討を開始した。広域宿主への接合伝達が可能なプラスミドは50kb以上とサイズが大きいため、導入に適した接合伝達プラスミドの構築操作が難航したものの、今年度の成果として大腸菌から真核細胞である酵母への接合伝達が可能であることを実証できた。さらに酵母のゲノムへの導入も確認でき、当該年度実施予定について順調に進捗している。以上、当初予定していた実験内容は一通り試みることができ、予定通りのペースで本計画が進行しており、おおむね順調に進展していると判断できる。

Strategy for Future Research Activity

初年度（2018年度）、次年度（2019年度）とおおむね当初予定していた研究項目を実施することができ、問題点の抽出及び解決法を導き出すことができた。これらの結果を受けて最終年度（2020年度）は、当初の予定通り効率的な「(1)コンティグクローンの連結法」及び「(2)動物培養細胞への導入法」を実践する。(1)についてはプロトプラスト法による形質転換法について、さらなる効率改善及びコンティグDNAが何断片まで連結可能か、どのくらいのサイズまでの長鎖DNAを構築できるかなどを検証し、実践的なプロトコルの確立を目指す。目的の形質転換体を得るために必要であれば昨年度までに検討した自殺遺伝子mazFを用いたセレクションの併用も検討する。「(2)動物培養細胞への導入法」と関連して「溶菌法」を用いる場合、効率化のため環状プラスミドDNAの線状化が必要な場合は枯草菌細胞中で発現できるI-SceI遺伝子の活用も検討する。また(2)については、動物培養細胞でのセレクション法のためのマーカー遺伝子を見直しつつ、「溶菌法」と合わせて「接合伝達法」の本格的な活用を検討する。「接合伝達法」では接合伝達プラスミド(ヘルパープラスミド)を用いた方法のみならず、接合伝達起点であるoriT配列のみを用いた小型のモバイルプラスミドによる方法についても検討する。50kb以上とサイズの大きい接合伝達プラスミド(ヘルパープラスミド)を用いるより、サイズが小さく加工しやすいモバイルプラスミドを用いた方が手軽に導入用のDNAが構築可能であり、将来的に接合伝達法を実施する上で重要なツールになると期待される。以上の研究計画を実施し、最終的に当初の目的である「水平伝播を利用したゲノム合成技術の実用化」を目指す。

Causes of Carryover

（理由）当該年度(2019年度)も研究の進展具合はおおむね順調で、当初の計画目標を充分に達成することができた。最終年度(2020年度)に向けて使用額が生じた理由としては、初年度見送った顕微鏡や微量遠心機用のロータラックなどの実験備品費分に加えて、消耗品費に関しても実験資材等の再利用などを心がけ、その他効率よく実験操作を進めることができた結果、必要な研究経費を最低限に抑えることができ、最終年度に向けて余剰分(繰越金)を残すことができた。

（使用計画）最終年度（2020年度）は、当該テーマの最終目標達成に向けて、これまでと同様に消耗品費として培養に必要な培養試薬類、培養資材類、またPCRや各種プラスミドDNAの構築や精製などのための遺伝子工学用試薬類、遺伝子工学資材類、プライマー合成費などが必要であると見込まれる。さらに単純な試薬の調整、培地の作成、操作、データの取りまとめを補佐する研究補佐(技術員1名)の人件費、及び情報収集、成果報告(学会発表、論文発表など)のための旅費、謝金(論文校閲料を含む)なども必要であり、最終年度(2020年度)に向けた繰越金を含め、これらの予算で必要充分であると見込まれる。