2020 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation for chaperone RNAs that prevent protein aggregation associated with neurodegenerative diseases.
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18K06201
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
北村 朗 北海道大学, 先端生命科学研究院, 講師 (10580152)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | RNA / タンパク質凝集体 / ALS / TDP-43 / 蛍光相関分光法 / 線虫 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
TDP-43CTFが認識するRNAのフォールド状態の変化を確かめるために，種々のカチオンを添加した条件で両者の相互作用を，蛍光相互相関分光法 (FCCS)を用いて解析した．緑色蛍光タンパク質GFPで標識したTDP-43CTFを発現するマウス神経芽細胞種Neuro2a細胞の細胞破砕液を用意し，種々のカチオン存在下でRNAと混合してFCCS解析を行った．結果，TDP-43CTFが明確なRNAフォールドを認識しているのではなく，フォールドの中で露出する部分的な配列を認識している可能性が示唆された．また，TDP-43CTFとRNAの相互作用に必要なドメインを，欠損変異体を用いたFCCS解析により確かめた．さらに，Neuro2a細胞にRNAを発現させることでTDP-43CTFの不溶性画分を減らせることが分かった．これらのことは，培養細胞を用いたRNAのシャペロン機能実証においてきわめて重要な証拠であると考える．
線虫における凝集抑制効果を確かめる系を確立するため，feeding法によりRNAを発現する大腸菌を線虫に食べさせ，その取り込んだRNAが機能することを確かめるために，RNAiの効率で判定を行ったところ，目的遺伝子のノックダウンがqPCRおよびウェスタンブロットにより確認できた．このことから，RNAを線虫内に取り込ませる系が確立できた．
さらに，TDP-43CTFを筋肉に発現する線虫の寿命解析を行い，コントロールと比べて有意に寿命が短くなることが示された．このことき，TDP-43CTFが毒性を持ち，寿命短縮に影響するものと考える．
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