2018 Fiscal Year Research-status Report

アクチン重合阻害剤に対するテトラヒメナの耐性能獲得機構の研究

Research Project

Project/Area Number	18K06204
Research Institution	University of Tsukuba
Principal Investigator	沼田治筑波大学, 生命環境系, 特命教授 (50189354)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	中野賢太郎筑波大学, 生命環境系, 教授 (50302815)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	テトラヒメナ / アクチン / 細胞骨格ホメオスタシス / アクチン重合阻害剤 / 転写調節 / ユビキチン化 / オートファジー / フィンブリン
Outline of Annual Research Achievements	アクチンは全ての真核生物に重要な細胞骨格であるが、細胞内アクチン濃度の制御機構は不明である。我々は、アクチン重合阻害剤に対するテトラヒメナの耐性獲得現象を発見した。これには、数十種類の遺伝子転写誘導とアクチン分子の活発な合成分解が伴う。この分子機構の根底には、アクチンが細胞機能を健全に発揮できるよう、最適な量と品質を感知・制御する「細胞骨格ホメオスタシス」の存在が伺えた。本研究ではテトラヒメナのユニークなアクチン重合阻害剤耐性機構を調べることで、「細胞骨格ホメオスタシス」の実体を探る。本研究課題の核心は、「細胞がアクチンの量をどのように感知し、制御するか？」という問いに、アクチン重合阻害剤で撹乱した状態から、テトラヒメナが適切な細胞骨格機能を回復する過程を調べ、解答を得ることである。平成30年度は研究計画1「細胞が重合してないアクチンの増加を感知し、それが一群の遺伝子の転写誘導を促すのか？」で2つの成果を上げた。① ACT1あるいは、繊維化しないACT1の過剰発現で、LA処理直後からLA耐性能を示すことが分かった。この結果は、ACT1の単量体アクチン量の増加が、ACT2とLA耐性能獲得遺伝子群の発現誘導を引き起こしていることを示す。② RNA seq で、ラトランキュリンA (LA) 処理時に転写量が顕著に増加する遺伝子を同定・分類し、2つの遺伝子、アクチン束化因子フィンブリンの遺伝子（FIM1）と転写因子遺伝子（LITAF）に着目した。FIM1破壊株は普段は野生株と同様に食胞を形成するが、LA耐性能を獲得できなくなった。したがって、LA耐性能獲得には多くの遺伝子の発現が不可欠であると考える。また、LITAF過剰発現株では、LA耐性能獲得が促進されることを発見した。転写因子LITAFが「細胞骨格ホメオスタシス」において重要な役割を担っていると考える。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究では上記研究計画1では、興味深い成果を上げることができたが、そのほかの２つの研究計画では十分な成果を上げられなかった。以下に、研究計画2と研究計画3の内容を示す。研究計画２「アクチンの分解機構をユビキチン経路かあるいは選択的オートファジー経路か？」では、以下のことを企画したが、十分な成果を達成できなかった。ユビキチン経路については、LA 処理細胞をプロテアソーム阻害剤で処理して、アクチン（ACT1）のユビキチン化状態について調べる。あるいは、リン酸化タンパク質の電気泳動度が大きく変化する Phos-tag ゲルを用いて、アクチンのリン酸化の変動を調べる。また、我々の先行研究で同定したユビキチンリガーゼやフラグミンキナーゼの遺伝子破壊株を作成し、アクチンのタンパク質量の変化や LA 耐性能の獲得に及ぼす影響を調べる。オートファジーについては、テトラヒメナの ATG8 の３つのアイソフォームの各遺伝子破壊を用いて、LA 処理後のアクチンの状態を野生株のものと比較する。その結果、アクチンの分解経路を特定する。研究計画３「アクチン量の不足を、細胞がどのように感知して、必要なアクチン量を合成するのか？」に関しては、研究計画１で転写因子LITAFが重要であることが分かったので、この転写因子の結合配列をゲルシフトアッセイ等で特定することを試みているが、十分な成果は上げられなかった。
Strategy for Future Research Activity	当初の計画通り、3つの研究計画を推進する。これらの具体的な内容は下記のとおりである。研究計画１「細胞が重合してないアクチンの増加を感知し、それが一群の遺伝子の転写誘導を促すのか？」：FIM1遺伝子破壊株がLA 耐性能を十分獲得できなかったので、そのメカニズムを解明するため、FIM1遺伝子破壊がアクチンの発現量に影響するか調べる。転写因子LITAFについては、YFP 融合タンパク質を過剰発現し、上記の遺伝子群の転写量を増加するか定量 PCR により調べる。また、転写因子LITAFがLA 処理時に核内に移行するなどの局在変化を示すか、蛍光顕微鏡観察する。その結果、細胞がアクチンの状態を核内に伝達し、遺伝子発現を誘導するしくみが理解できると考える。研究計画２「アクチンの分解機構をユビキチン経路かあるいは選択的オートファジー経路か？」：LA 処理細胞をプロテアソーム阻害剤で処理して、アクチン（ACT1）のユビキチン化状態について調べる。あるいは、リン酸化タンパク質の電気泳動度が大きく変化する Phos-tag ゲルを用いて、アクチンのリン酸化の変動を調べる。また、我々の先行研究で同定したユビキチンリガーゼやフラグミンキナーゼの遺伝子破壊株を作成し、アクチンのタンパク質量の変化や LA 耐性能の獲得に及ぼす影響を調べる。オートファジーについては、テトラヒメナの ATG8 の３つのアイソフォームの各遺伝子破壊を用いて、LA 処理後のアクチンの状態を野生株のものと比較する。その結果、アクチンの分解経路を特定する。研究計画３「アクチン量の不足を、細胞がどのように感知して、必要なアクチン量を合成するのか？」：ACT1 と ACT2の遺伝子の上流配列から、研究計画１で同定した転写因子LITAFの結合配列をゲルシフトアッセイ等で特定する。その結果、両遺伝子の転写調節の違いを理解する。