2018 Fiscal Year Research-status Report
オルガネラ(液胞/リソソーム)による細胞周期制御機構の解明
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18K06211
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
神 唯 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 特任准教授 (40802335)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 液胞 / オルガネラ / 細胞周期 / 酵母 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
「液泡は細胞周期の進行に必須である」ことは明らかとしたが (Jin and Weisman, 2015)、その分子的詳細は不明である。申請者は、液胞を介した細胞周期制御に関わる新規因子の同定を目指し、液胞分配変異との合成致死変異体スクリー ニングを行った。結果、液胞変異との合成致死性を示す遺伝子としてBUR1を同定した。本研究申請書においては以下の研究を計画していた。本研究期間内(平成30-32年度)に、1) 新規に同定したBUR1遺伝子の機能解析から、液胞からのシグナルがどのように細胞周期制御に至るのかについて詳細を明らかにする。さらに生化学的な観点から、2) 質量分析を用いた液胞構成因子の網羅的解析により、細胞周期進行に関わる液胞構成因子候補の選定及び、その因子の細胞周期進行における役割の解明を目指す。また、上記の研究と並行して、さらなる変異体スクリーニングにより、3)オルガネラチェックポイントの分子実体(遺伝子)の解明を目指す。
現時点で、1) in vitroにおけるBur1キナーゼによる標的タンパク質のリン酸化部位を質量分析器により同定した。現在、in vivoにおいても同部位がリン酸化されるかどうかの検証を行なっている。2)野生型酵母の液胞と、新規液胞生成に重要な働きを示すPEP12の変異体から液胞を単離し、液胞構成因子を質量分析器により比較解析した。野生型酵母の液胞と、pep12変異体の液胞の存在比に五倍以上の差が認められるタンパク質を数十同定した。現在候補タンパク質について、細胞周期制御との関わりについて検証を行っている。3) 変異体スクリーニングによりオルガネラチェックポイント制御に関わる可能性のある候補遺伝子を次世代シークエンスにより複数同定した。復帰変異体１１から原因遺伝子７つを同定し、候補遺伝子の解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
1) in vitro キナーゼ反応によるリン酸化部位の同定に困難はなかったが、in vivoにおいてBur1キナーゼの活性を変化させたときの、標的タンパク質のリン酸化変動の解析に時間を用している。Bur1は必須遺伝子であり、まず機能欠失の条件設定に時間を要し、さらにリン酸化プロテオームの条件設定に時間を要した。現在、これら実験条件設定が終わった段階であり、Bur1の機能を欠失させた酵母株での、標的タンパク質のリン酸化変化を時系列的で追うことに集中している。
2) pep12変異体酵母からの液胞精製によるスクリーニング結果から得られた候補因子が多いため、同様の表現系を示すvps45変異体からの液胞精製のデータを合わせることで候補因子の絞り込みを計画している。
3) オルガネラチェックポイントのスクリーニングについては、順調に原因遺伝子が７つ同定された。今後は、既知の機能情報を元に絞り込みを行い、機能解析を進めていく計画である。
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| Strategy for Future Research Activity |
Bur1による標的タンパク質のリン酸化を、in vitro、in vivoで検出し、リン酸化標的アミノ酸が確定したのち、リン酸化抗体を作成する予定である。リン酸化抗体を用いることで、「いつ」リン酸化が行われるのかという疑問に答えることができると考えている。生化学的スクリーニング及び、オルガネラチェックポイントに関する遺伝学的スクリーニングは、このまま計画通りに進めていく予定である。
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Research Products
(3 results)
