2019 Fiscal Year Research-status Report
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18K06225
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| Research Institution | Osaka City University |
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Principal Investigator |
中村 太郎 大阪市立大学, 大学院理学研究科, 教授 (30291082)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 中心体 / 酵母 / 膜 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
「微小管の形成中心」としての中心体のはたらきについては世界的に盛んに研究されてきた。一方で、中心体は「細胞膜の形成起点」としてもはたらいているが、微小管形成に関する役割に比べて研究例も少なく、その分子メカニズムは不明な点が多い。分裂酵母の胞子細胞膜の形成は、中心体（酵母ではスピンドル極体SPBとよばれる）から始まる。本研究の最終目的は、分裂酵母の胞子細胞膜形成の中で特にSPBにおける膜形成開始に焦点を当て、形成に必要な遺伝子の同定と解析により、その分子メカニズムを解明することである。電子顕微鏡による観察で、胞子形成時にはSPBの細胞質側にMOP (meiotic outer plaque)という層状の構造が形成されることがわかっている。これまで、申請者らはMOPを構成するタンパク質を数個明らかにしてきた。しかしながら、これらをSPBにつなぐしくみはわかっていなかった。本研究ではゲノムワイドな逆遺伝学と生化学的手法を組み合わせ、このしくみ解明を目指す。この過程についてはすでにCa2+シグナリングに中心的なはたらきをするカルモジュリンが関わることが明らかになっている。本年度は、カルモジュリンがSPBの構造タンパク質Spo15と直接結合することを明らかにした。Spo15のさまざまな欠失変異を作製、その局在と機能について調べたところ、Spo15はC末端側でCa2+依存的にカルモジュリンを介してSPBに結合・局在し、N末端側でSpo2などのより胞子細胞膜形成に近いタンパク質と結合することがわかった。また、Spo15は巨大なタンパク質であるが、その中央部分はSPB本体と膜形成が行われている場所の空間的な距離を作るのにはたらいているというモデルを構築した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
酵母ツーハイブリッド法およびプルダウン法により、カルモジュリンが、Ca2+依存的にSpo15と直接結合することを明らかにした。Spo15は約2000アミノ酸からなる非常に巨大なSPBの構造タンパク質である。様々なSpo15部分欠失変異タンパク質を発現させ、その機能について調べた。その結果、SPBへの局在にはC末端側約500アミノ酸の領域が必要であることが明らかになった。特に1500-1600アミノ酸の領域は安定してSPBに局在するために必要であった。次に、カルモジュリンとの結合領域を調べたところ、こちらについてもC末端側約500アミノ酸が必要であった。また、Spo15は胞子細胞膜形成に関わる別のSPBタンパク質Spo2と結合することが知られているが、Spo2との結合には、逆にN末端側130番目から60アミノ酸が必要であることがわかった。Spo2はさらに別のSPBタンパク質を介して胞子細胞膜形成の場所となると考えられている。興味深いことにSpo15の中央部分約1200アミノ酸を欠失させても胞子細胞膜形成はある程度おこった。以上の結果から、Spo15はC末端側でCa2+依存的にカルモジュリンを介してSPBに結合・局在し、N末端側でSpo2などのより胞子細胞膜形成に近いタンパク質の足場となり、その中央部分はSPB本体と膜形成が行われている場所の空間的な距離を作るのにはたらいている可能性が示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの結果より、SPBの膜形成にはCa2+シグナルが重要な役割を果たしていることが明らかになっている。このしくみを明らかにするためにカルモジュリンとSpo15(1500-1957)を合わせて出芽酵母内で発現させ、酵母スリーハイブリッドスクリーニングを行う。すでに、予備実験は終了し、いくつかの候補クローンを得ている。これらの中にはカルモジュリン/Spo15複合体が結合するSPB本体のタンパク質が含まれていると考えており、その同定を行いたい。また、SPBの構造が変化し、膜形成の場となるのは第一減数分裂から第二減数分裂時であると考えている。この時期の細胞質Ca2+の濃度をリアルタイムで観察したい。分裂酵母ではイクオリンの発光を利用する系が利用できることが知られている。すでに観察系の構築は成功しているので、あとは観察を行うだけである。
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| Causes of Carryover |
分子生物学関連の試薬が予想よりも少なくすんだため、その予算を来年度分とした。
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