2018 Fiscal Year Research-status Report
腎糸球体上皮細胞の突起形成におけるアクチン細胞骨格制御機構の解明
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18K06227
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
斉藤 康二 北里大学, 理学部, 講師 (70556901)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
太田 安隆 北里大学, 理学部, 教授 (90192517)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ポドサイト / 突起構造 / Rac / FilGAP / ROCK |
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| Outline of Annual Research Achievements |
腎糸球体上皮細胞(ポドサイト)は、細胞骨格に支えられた突起構造が発達しており、その形成と維持は腎臓の濾過機能に必須である。アクチン細胞骨格の制御に重要な役割を果たすRho small GTPase Racの過度な活性化が突起形成を阻害することから、その活性の抑制が突起形成に重要であると考えられる。本研究では、ポドサイトにおけるRac活性の抑制に関わる候補分子として、その不活化因子であるFilGAPに着目した。実験にはラットポドサイト由来C7細胞株を用いた。C7細胞はフォルスコリン(FSK)で処理すると生体に近い突起構造を誘導できる実験系である。本年度は以下の成果を得た。1) FilGAPのノックダウンはFSK誘導性の突起形成を抑制した。この抑制効果はRacの阻害剤処理により回復した。さらに、FilGAPのGAP活性がない優勢阻害型変異体の発現によっても突起形成は抑制された。これらの結果から、FilGAPによるRacの不活化が突起形成に重要であることが示唆された。2) 上記の結果は、FilGAPが突起の形成に重要であることを示唆している。FilGAPが突起構造の維持に関与するかどうか調べるため、FSK処理して突起形成を誘導した後、FSKをwashoutして突起構造が消失する様子を解析した。その結果、FilGAPのノックダウンによって突起の消失が顕著に早くなったことから、FilGAPが突起構造の維持にも関与していることが示唆された。3) FilGAPはRhoキナーゼ(ROCK)によってリン酸化されると活性化する。ROCKによるFilGAPのリン酸化が突起形成に重要かどうか調べた。ROCKによってリン酸化されない優勢阻害型変異体および疑似リン酸化型変異体、いずれを発現させても突起形成に影響がなかったことから、ROCKによるリン酸化は突起形成に関与しないことが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
以前の報告から、Racの過度な活性化が生じているマウスにおいてポドサイトの突起構造が消失していることが示されている。これはRacの阻害剤処理によって回復したことから、Racの活性を抑制することが突起形成に重要であると考えられる。本研究では、ポドサイトにおいてRacの抑制に関わる候補分子としてFilGAPに着目した結果、FilGAPによるRacの不活化が突起構造の形成と維持に重要であることが示唆された。突起形成へのFilGAPの関与が十分に示唆されたため、更なる解析を進めた。本年度は、FilGAPの機能制御メカニズムとして、ROCKによるFilGAPのリン酸化が突起形成に関与しているかどうか調べた。その結果、そのリン酸化は突起形成には関与していないことが示唆された。上皮細胞やがん細胞を含む細胞種でROCKによるFilGAPのリン酸化がその活性化に重要である一方、今回の結果は、ポドサイトの突起形成においては別の活性制御メカニズムが存在することを示唆している。本研究課題では以下の４つの項目を当初研究計画として挙げていた：① FilGAPの突起形成への関与 ② ROCKによるFilGAPのリン酸化の突起形成への関与 ③ 突起構造におけるFilGAPの局在と相互作用する分子との関連 ④突起形成におけるRacシグナル下流の分子メカニズム。本年度は、①②の解析を中心に行った結果、ポドサイトにおいてFilGAPが突起構造の形成と維持に重要であること、ROCK以外のFilGAPの活性制御メカニズムが存在することが示唆された。以上の研究成果から、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究方針として、上記２つの項目③④を進めていく。まず、③ ポドサイトの突起形成においてFilGAPの機能がどのように制御されているのか、その局在や相互作用する分子との関連を調べる。細胞内局在は、以前に作製した抗FilGAPポリクローナル抗体を用いて内在性のFilGAPの局在を調べる。FilGAPと同時に様々な細胞骨格制御因子の局在を調べ、FilGAPとそれらの分子との局在の関連を調べる。詳細な局在解析が必要な場合、超解像顕微鏡(所属大学内)を用いて解析する予定である。以前にFilGAPと相互作用する分子として、アクチン架橋タンパク質フィラミンA、Arf small GTPase Arf6、ならびにイノシトールリン脂質PIP3を同定している。これらが突起形成のおけるFilGAPの機能を制御しているかどうか調べる。関連がなかった場合、免疫沈降実験ならびに質量分析法(所属大学内)により、新たに相互作用する分子の同定を試みる。次に、④ 突起形成におけるRacシグナル下流の分子メカニズムを調べる。すなわち、なぜRacが過度に活性化すると突起が消失するのか、その作用機序を明らかにする。Racは様々な標的分子(エフェクター分子)を活性化してその下流にシグナルを伝達する。これまでに、FSK処理前に比べて突起形成が誘導された処理後にRacの活性が低下していることを明らかにしている。そこでまず、Rac活性の低下にともなって活性や局在など、その機能が低下するエフェクター分子を探索する。機能低下がみられるエフェクター分子が同定された場合、それらの機能を向上させたときの突起形成に与える影響を調べる。Rac下流のシグナル経路の解析は、ポドサイトを原因とした新たな腎疾患関連遺伝子の解明につながることが期待できる。
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Research Products
(2 results)
