2020 Fiscal Year Research-status Report

Characterization of structure dependent CAPN7 activity

Research Project

Project/Area Number	18K06236
Research Institution	Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
Principal Investigator	小野弥子公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, プロジェクトリーダー (20392376)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2022-03-31
Keywords	プロテアーゼ / 相互作用タンパク質 / プロテアーゼ複合体
Outline of Annual Research Achievements	カルパイン7のプロテアーゼ活性検出が可能な系、及び、新規結合タンパク質との関係性解析を継続した。また、ノックインマウスとノックアウトマウスとの違いについても比較検討をすすめた。 1) 昨年度よりカルパイン7欠失変異体の発現コンストラクトと、それを用いた活性検出を行っている。数種類の発現系・条件を検討してしてみたが、可溶性画分へと回収できる条件がこれまで見つからなかった。 2) BioIDにより同定したカルパイン7の結合タンパク質の中に存在する特異的ドメイン構造について、その部分だけでの発現コンストラクトを作製した。 3) ノックインマウスの産仔について、ノックアウトマウスと生存曲線が異なる傾向を認めた。公開されているプロテオーム及び遺伝子発現変動のデータから、カルパイン7の発現変動が認められる組織、条件などを検索して、今後の解析中心とする現象を検討した。 4) カルパイン7のプロテアーゼドメインについて、他のカルパイン分子種との比較、キメラ化により、活性化できるのかを検討するという方法論を検討した。二分子に分割して発現させる方法では、プロテアーゼドメインでの複合体形成は認められず、クラシカルなカルパイン分子種とは相補性がないと結論した。 5) カルパイン7のプロテアーゼドメインよりC末端側の部分について、他の生物種のカルパイン7ホモログとの相同性を検討し、プルダウンのためのコンストラクトを設計した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason これまでに同定した相互作用タンパク質について、解析用の発現コンストラクトと細胞株の作製が予定通りに進まなかった。マウスの組織に発現しているCAPN7タンパク質の精製と、共精製タンパク質の同定を計画していたが、条件検討までにとどまってしまった。マウスについては、希望したラインが確立できたが、解析に十分なスケールで継代が出来なかったため次年度での解析完了を目指すことにした。
Strategy for Future Research Activity	ノックアウトマウスとノックインマウスの表現型比較を継続する。野生型と活性欠失型の比較を行うため、それぞれを組織から精製し、挙動及び共存タンパク質を解析する。この過程で、内在性のカルパイン7からは活性が検出できるか、複数種類のカルパイン基質で検討する。組み換えタンパク質の発現が難航した部分を補完できるような知見を得たい。
Causes of Carryover	今年度は実験の規模が予定より小さかったこと、予定よりも進捗が遅れたため物品費の支出額が減少したこと、が原因である。最終年度には滞りなく実験を行いたく、そのための消耗品購入に使用する予定である。