2018 Fiscal Year Research-status Report
Dissection of nuclear envelope assembly by constitutive approach using artificial beads in living cells
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18K06238
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| Research Institution | National Institute of Information and Communications Technology |
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Principal Investigator |
小林 昇平 国立研究開発法人情報通信研究機構, 未来ICT研究所フロンティア創造総合研究室, 研究マネージャー (40425765)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 人工ビーズ / 核膜形成 / 構成的アプローチ / importin-beta / BAF |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、研究代表者がこれまでに開発してきた「生細胞内への人工ビーズ導入法」を利用した構成的アプローチによって、ビーズ周囲に機能的な核膜を形成させる条件を探索し、核膜形成機構の一旦を明らかにすることを目的とする。研究実施計画のうち、ビーズ周囲での核膜形成に必要な因子の探索として、初年度には、ヌクレオポリン等の核膜（孔）関連因子について、GFPとの融合タンパク質をコードするDNAコンストラクトを設計・作製し、それをHeLa細胞に導入して、安定発現株の作製を行った。得られた細胞株、及び、予備実験として既に取得してあったGFP-BAF発現株、GFP-importin-beta発現株等に対して、抗GFP抗体結合ビーズを導入して細胞内で目的タンパク質結合ビーズを構築し、ビーズ周囲に形成された膜構造について、核膜関連因子に対する免疫染色、及び、生細胞蛍光－電子相関観察法（ライブクレム法）を用いた膜長等の計測を行なった。その結果、BAF結合ビーズの場合には、ビーズ周囲に核膜孔複合体を持たない核膜様構造が形成されるのに対し、importin-beta結合ビーズや一部のヌクレオポリン結合ビーズの場合には、核膜孔複合体を有する核膜が効率よく形成されることが分かった。以上の結果から、核膜形成には、核膜孔複合体を伴わない膜構造形成と、核膜孔複合体を伴う膜構造形成の、少なくとも二種類の膜形成過程が関与していると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初予定していたDNAコンストラクトについては設計・作製ともに完了し、それを用いた安定発現株の取得についても順調に進捗している。また、これらのうち一部のものについては、すでに抗GFP抗体ビーズを用いた核膜形成実験を開始しており、核膜関連因子を含む核膜様構造を形成する候補因子を見出していることから、研究計画は順調に進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の計画通り、作製が完了した安定発現株に対して、順次、抗GFP抗体ビーズの導入実験を行い、ビーズ周囲に形成される膜構造の解析を行う。また、核膜孔成分を有する連続した膜構造の形成が見られた場合には、核移行シグナルを有するタンパク質を用いた核輸送アッセイによって膜の機能解析を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
当該年度に行った研究が順調に進捗し当初想定以上の実験結果が得られたため、その成果とりまとめ作業を優先することとした。このことから、次年度使用額分については、得られた実験結果に基づくより発展的な研究や成果発表等の目的で、翌年度分と合わせて効率よく使用する予定である。
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