2019 Fiscal Year Research-status Report
脊椎動物胚の細胞にかかる力が予定運命に与える影響の検証
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18K06244
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
道上 達男 東京大学, 大学院総合文化研究科, 教授 (10282724)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山元 孝佳 東京大学, 大学院総合文化研究科, 助教 (70724699)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 細胞張力 / 外胚葉パターニング / 平面内細胞極性 / 伸展刺激 / 細胞骨格 / モータータンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
脊椎動物初期胚の外胚葉は、神経板、神経堤、プラコード、表皮の4領域から構成される。これらの領域規定はBMP・FGFやWntシグナルの仮想的濃度勾配によって決定されると考えられている。研究代表者はこれまで、将来感覚器や末梢細胞に分化するプラコード領域の形成機構について、新規遺伝子の解析を通して研究を行ってきた。その過程で、プラコード形成に細胞張力が関与するのではという着想に基づき、外胚葉領域の各細胞にかかる張力をFRET張力プローブの胚への導入によって計測したところ、神経外胚葉と表皮外胚葉で細胞にかかる張力が異なることを見出した。本研究では、細胞に対して力を加えたとき、外胚葉の予定運命が変化するかどうかを検証することを通し、外胚葉パターンの規定における物理的な力の関与を明らかにすることを目的としている。昨年度は神経板の平面内細胞極性（PCP）に着目し、伸展刺激、やレーザー破壊による張力変化によるPCP変化を検証した。また、恒常活性型ミオシン軽鎖(caMLC)の微量注入によるプラコード領域の変化を調べた。本年度は、（1）神経板におけるPCP形成について、張力の方向依存性を検討した結果、予想通りPCPへ与える張力の影響には方向依存性があることが明らかとなった。同様に、神経板領域のPCP形成に対する外力の効果も、力のかかる方向によって異なることを明らかとした。 (2)昨年に続き、caMLCを用いた外胚葉パターニングに対する力の関与を調べた。今年度はcaMLCの過剰発現と張力発生の関係を調べるため、caMLC注入領域・非注入領域双方の外胚葉細胞の形状を調べた。(3)外胚葉細胞に伸展刺激を加えた際の変形度が、神経・表皮領域間で異なるかどうかを調べ、実際に違いがあることを見いだした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、以下の2点について主に研究を行った。
(1)神経板におけるPCP形成に対する細胞張力の影響について、昨年度に引き続き研究を行った。PCP形成に関わる張力の方向依存性を検討した結果、注目する細胞のAP軸近傍のレーザー破壊を行うとPCP形成が大きく乱れるのに対し、ML（横）軸近傍に行うとPCP形成の大きな乱れは認められなかった。このことは、PCP形成の張力の関与に関し、方向依存性があることを示唆する。また、神経板領域に伸展刺激を加えるとPCP形成に影響を生じるが、これについても伸展方向の依存性を調べたところ、AP方向への伸展刺激では非刺激時と大きく変化はなかったが、ML方向に伸展刺激を加えると、PCP形成が乱れることを見いだした。以上の結果は、PCPの正しい形成には細胞張力がAP方向に加わることが重要であることを示唆する。
(2)神経板の近傍領域に恒常活性型ミオシン軽鎖キナーゼ(caMLC)を微量注入したときの、神経板・プラコードマーカーの発現の変化を調べた。その結果、MLC注入領域近傍においてプラコード領域の拡大が観察された。caMLC注入により細胞に張力が実際に付与されているかが問題であるが、caMLC注入胚における外胚葉細胞の形状を調べたところ、注入領域近傍の細胞形状の変化が観察された。このことより、注入領域近傍の細胞に何らかの張力が付与されている可能性が示唆された。
(3)神経―表皮境界の形成の張力依存性を調べるため、外胚葉細胞シートに伸展刺激を加えた際の変形度が予定神経外胚葉、予定表皮外胚葉間で違いがあるかを調べた。BMP阻害因子の導入により神経に予定運命を変化させた細胞シートは、表皮運命のシートより伸展度が小さいことを見いだした。この結果は、実際の胚における各領域の変形に何らかの影響を与えることを示唆している。
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| Strategy for Future Research Activity |
（1）PCP形成については、AFMなどを用いて神経板にかかる張力の実測を行い、PCP形成と張力との関係について直接的な検証を行う。また、細胞形状情報の取得を通し、数理的なアプローチによってもPCP形成と力との関係を示すデータの取得を目指す。これについては、すでにMatlabやimageJ等の解析手段が確立しているので、これらを活用する。
（2）caMLCによる張力付与が外胚葉の予定運命に与える影響の解析としては、ML7やサイトカラシンなど、ミオシン軽鎖の機能やアクチン重合を阻害した場合について調べる。また、 細胞形状解析では、caMLC注入領域だけでなく、その周辺の細胞の形状の変化がどのようにみられるか、更にはそれが各外胚葉領域のパターン形成とどのように相関するかを、核外胚葉マーカー遺伝子のinsitu ハイブリダイゼーションによる発現パターンと細胞トレース（membraneGFP の注入、あるいはファロイジン染色）による細胞形状情報とを組み合わせることによって明らかにしたい。
（3）昨年度の結果より、予定神経外胚葉と予定表皮外胚葉間で水平方向の伸展度が異なることを見いだした。今年度は、この伸展度の方向依存性があるかどうかを調べる。また、昨年度十分に進めることのできなかった細胞骨格・細胞骨格関連タンパク質の関与を調べたい。まず、伸展刺激を加えたとき、細胞骨格（アクチン）や関連タンパク質（アクチニンなど）の局在変化の有無を調べる。また、外力によって予定運命が変化することが予想されるが、この影響が細胞骨格や細胞骨格関連タンパク質の過剰発現またはノックダウンによって変化するかどうか調べる。
(4)FRET プローブを用い、外胚葉細胞シートに伸展刺激を加えた際のFRET値の変化に方向依存性があるかどうか、また頂端面からみた細胞の“辺“長の変化度合いと張力の大きさとの関連を調べたい。
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| Causes of Carryover |
本年度は、予定していた学会への参加をキャンセルしたことが挙げられる。また、使用を予定していた消耗品の一部の購入が必要なくなったため、来年度に繰り越して使用することとした。
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Research Products
(11 results)
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[Book] 生物学入門 第三版2019
Author(s)
嶋田正和、上村慎治、増田建、道上達男（編）
Total Pages
298
Publisher
東京化学同人
ISBN
9784807909520
