2019 Fiscal Year Research-status Report
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18K06253
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
大塚 俊之 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 准教授 (20324709)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | Hes / Shh / 神経幹細胞 / 脳発生 / 脳進化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
hSmoM2 (活性型human Smoothened) 強制発現マウスの解析を進め、生後脳においても脳室帯および脳室下帯において多くのPax6陽性神経幹細胞が増殖を続けており、これらの一部はbasal radial glia様の細胞（神経幹細胞）であることが示唆された。Doxycycline (Dox) を胎生11.5~12.5日目から投与した際に再現性良く脳の皺状の構造が認められ、その形成パターンにも共通性が認められた。そこで皺状構造と大脳皮質層構造との関連を調べるため各層のニューロンのマーカーを用いて免疫組織染色を行ったところ、皺状構造を境界として層構造の違いが観察された。Shh強制発現マウスにおいては発現量の調整（Dox投与量および投与時期の検討）を行った結果、生後まで生存可能なマウスが得られ、生後および成体マウスにおける表現型の解析が可能となった。Shh強制発現マウスにおいてもhSmoM2強制発現マウスと同様な脳表の皺状構造が認められており、皺状構造と層構造との関連および脳領野との関連に関して今後更に詳細な解析を進める。
脈絡叢特異的にrtTA発現させるため、マウスTransthyretin (Ttr) プロモーターおよびフグOtx2プロモーターとF3転写制御領域をつないだF3FuguOtx2プロモーターを用いてTgマウスを作製した。まずpTtr-rtTA Tgマウスを用いて脈絡叢特異的にShhを強制発現するマウスを作製し解析したところ、脈絡叢上皮細胞の増殖促進による脈絡叢サイズの増大と、神経幹細胞・前駆細胞におけるShh強制発現マウスと同様な表現型（神経幹細胞・前駆細胞の増殖促進、脳室および脳室周囲帯の拡大、脳表面積の顕著な拡大）が認められた。またF3FuguOtx2-rtTAプロモーターが脈絡叢上皮の前駆細胞において発現することを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Hes1単独の強制発現マウスについては、その成果をまとめ初回投稿を終えた。hSmoM2およびShhを発現するTgマウスについてもDox投与量および投与タイミングの調節を行い、より顕著な表現型の獲得、生後・成体まで生存可能な条件、皺状の構造が再現性良く認められる条件の検討が進んでいる。今後は生後・成体において更に顕著な脳回・脳溝の形成が認められる条件を検討する。他のTgマウスライン（Hes1, Hes5, hHES4強制発現マウス等）との掛け合わせにおいても、それぞれに最適な条件検討を行う予定である。Shh強制発現マウスにおいても生後まで生存可能なマウスが得られ、生後および成体マウスにおける表現型の解析が可能となった。今後成体ニューロン新生における影響の解析に進む。
hSmoM2およびShh強制発現マウスにおいて、再現性良く脳の皺状構造を認める条件が得られ、その形成パターンの共通性、皺状構造を境界とした層構造の違いが認められている。今後更に詳細な解析に進む予定である。
pTtr-rtTA Tgマウスにおいては脈絡叢特異的にShhを強制発現するマウスの作製と解析が進んでおり、今後Shh以外の候補因子を発現（分泌）するマウスを作製し解析を進める。pF3FuguOtx2-rtTA Tgマウスにおいては脈絡叢上皮の前駆細胞において発現を確認しているが、この前駆細胞の増殖を促進し脈絡叢サイズの増大をもたらす候補因子の同定を目指す。
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| Strategy for Future Research Activity |
Tet-Onシステムを用いてhSmoM2を発現するTgマウスについては、脳表の皺状の構造（脳溝）の形成パターン、形成メカニズムについてさらに詳細な検討を行う。皺状の構造の形成場所の組織学的な特性を免疫組織化学を用いて解析する。特に脳領野形成と脳溝形成との関連を調べるため、大脳皮質の各層のニューロンのマーカーを用いて層構造の解析を行うとともに、各領野のマーカーを用いて免疫組織染色およびin situ hybridizationにより 脳領野における層構造の違いが脳溝形成に及ぼす影響を調べる。他のTgマウスライン（Hes1, Hes5, hHES4強制発現マウス等）との掛け合わせを行い、脳溝形成がより顕著に再現性高く認められる条件を検討し、脳回・脳溝形成のモデルシステムを確立する。
Shh強制発現マウスにおいては、引き続き生後の大脳皮質拡大および大脳皮質ニューロン数の増大をもたらす条件の最適化（Dox投与量および投与タイミングの検討）を行うとともに、成体脳における神経幹細胞の維持、ニューロン新生能の評価を行う。また生後および成体脳においてShhを強制発現することにより、神経幹細胞・前駆細胞の増殖が促進されニューロン新生が活性化されるか検討を行う。
更にpTtr-rtTA Tgマウスを用いてShhや他の候補因子（大脳皮質神経幹細胞の維持・増殖を促進する因子等）を脈絡叢特異的に発現させるマウスを作製し、脳脊髄液中に分泌された因子が脳形態形成に及ぼす影響を解析するとともに、脈絡叢上皮細胞・前駆細胞の増殖促進活性、脈絡叢のサイズの増大が認められるかについても解析する。pFuguOtx2-rtTA Tgマウスについても、脈絡叢上皮細胞・前駆細胞の増殖を促進する候補遺伝子を発現させることで脈絡叢のサイズの増大および脳形態形成に及ぼす影響を解析する。
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| Causes of Carryover |
今年度は各種トランスジェニックマウスの作製・交配・表現型解析（一次スクリーニング）を中心に行い、次年度以降更に詳細な解析を進めるため、一部の分子生物学用試薬・免疫組織（細胞）化学用試薬・プラスチック製品等の購入を次年度以降に回す形となった。
次年度は主に遺伝子改変マウス解析にかかる消耗品（分子生物学用試薬・免疫組織（細胞）化学用試薬（各種抗体等）・プラスチック製品等）・交配用マウス購入・マウス維持等に使用する。また一部はデータ解析・整理及び成果発表にかかる費用（データ印刷・複写費、現像・焼付費、学会参加のための国内旅費・外国旅費、論文校正費・投稿料・掲載料・別刷費用等）として使用する予定である。
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Research Products
(2 results)
