2019 Fiscal Year Research-status Report

器官再生を惹起するROSシグナルの解明

Research Project

Project/Area Number	18K06257
Research Institution	Hiroshima University
Principal Investigator	鈴木賢一広島大学, 統合生命科学研究科(理), 特任准教授 (90363043)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	器官再生 / 両生類 / ゲノム編集 / トランスクリプトーム解析 / ROS
Outline of Annual Research Achievements	生物の器官再生において、活性酸素(ROS)が重要な役割を担っていることが注目されている。しかしながら、その作用機序は未だ不明である。これまでに得た知見から、申請者は「ROSがエピジェネティクス修飾の変化を誘導し、器官再生を惹起する」という仮説を立てた。申請者が得意とするオミックス解析やゲノム編集技術を駆使して、器官再生におけるROSシグナルの重要性とエピジェネティクス修飾へと変換される一連の作用機序を解明することが本申請課題の最終目的である。本研究課題では、高い器官再生能力を持ち、超高効率のゲノム編集が可能であるイベリアトゲイモリをモデルとして用いる。本研究から得られる成果は、発生・再生生物学におけるROSの新たな生物学的意義の発見につながる。くわえて、現在注目度の高い再生医学分野において、器官再生に関する重要な知見をもたらすことも期待できる。本年度は、複数の大学・研究機関と共同で大規模なRNA-seq解析によるイベリアトゲイモリトランスクリプトームデータセットを論文として発表した。また、CRISPR-Cas9ノックアウトによる遺伝子機能のin vivo解析の際に必要である、NGSを用いたジェノタイピング解析法も論文として発表することができた。加えて、四肢再生芽におけるROSの関与を明らかにすべく、ディーププロテオミクス解析、さらには先進ゲノム支援の協力の下にIso-seqを用いた完全長転写産物配列の取得も進めた。その結果、四肢再生時に発現が強く誘導されるROSシグナリング関連の遺伝子を複数同定することができた。これらROSシグナリング下流にある候補遺伝子群のノックアウト変異体の作出を行い、および器官再生におけるROSシグナリングを解析するために有用なトランスジェニック体の作出も進めている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason RNA-Seq・プロテオミクス・Iso-Seqによる包括的なオミックス解析によって、イモリ四肢再生芽の分子的特徴の全貌が見えてきた。特に本研究課題の目的である、器官再生の際に強く活性化されるROSシグナリング遺伝子群が同定できたことは大きな成果であると考える。この得られた結果から、ROSに関与するミトコンドリア呼吸関連の遺伝子、転写制御因子、分子シャペロン、さらにはその下流のECM合成へと流れる一つの分子機構（カスケード）を想定することができた。現在はこのROSシグナリング下流で器官再生を制御していると考えられる遺伝子群のノックアウト変異体の樹立を行なっている。さらには、四肢再生におけるROSシグナリングの関与を解析するため、エピジェネティクスの変動解析や局所的にROSを活性化させるための新しいトランスジェニック変異体の作出も鋭意進めている。次年度はこれら得られた変異体を用いて、さらなるRNA-Seq解析やエピジェネティクス解析を行い、器官再生におけるROSシグナルの重要性とその分子機構を明らかにする予定である。
Strategy for Future Research Activity	本年度作製した変異体やトランスジェニック体を用いて、ROSシグナリング遺伝子群の器官再生への関与を精査する。さらなるオミックス解析により、トランスクリプトームやプロテオームの変動を捉え、器官再生におけるROSシグナリングの分子機構をより詳細に明らかにする。イモリを用いた器官再生研究においてゲノムデータ（遺伝子構造やプロモーター配列の情報）は必要不可欠であるため、研究コンソーシアムとの共同研究により、ゲノム解析も行う予定である。このゲノムデータを用いて、四肢再生時のエピジェネティクス解析も行いたい。さらには新しい組織解析法を取り入れ、ROSシグナリングカスケードをより詳細に解明するための発展的な研究も計画している。次年度は最終年度であるため、上記全ての知見を集約し、論文や学会発表という形で成果の取りまとめを進めたい。
Causes of Carryover	今年度末に広島大学から基礎生物学研究所への移動にともない、研究予算の使用計画に若干の変更が出た。その結果として約５万円程度の差額が生じた。出た差額は消耗品（試薬購入やイモリの餌代）としたい。