2019 Fiscal Year Research-status Report

Development of a culture system for in vitro derivation of haematopoietic stem cells from murine embryonic stem cells

Research Project

Project/Area Number	18K06262
Research Institution	Kumamoto University
Principal Investigator	小川峰太郎熊本大学, 発生医学研究所, 教授 (70194454)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	ES細胞 / 造血幹細胞 / 造血性内皮細胞 / 血管内皮細胞 / single cell RNA-seq
Outline of Annual Research Achievements	本研究の目的はマウスES細胞から造血幹細胞(HSC)を分化誘導する培養系の確立である。HSCはマウスの発生において背側大動脈の造血性内皮細胞(HEC)(胎生9～10日)からプレ造血幹細胞(pre-HSC)(胎生10～11日)を経て分化する。そこで、マウス胎仔からセルソーターで単離したHECとpre-HSCを培養してHSCに分化させる実験系の確立を目指している。まず、胎生11日のpre-HSCを特定のサイトカインのみで無血清培養し、放射線照射された成獣マウスに移植可能なHSCを誘導することに成功した。次に、胎生10日のpre-HSCを、間葉系細胞株、あるいは間葉系細胞株＋血管内皮細胞株と共培養を行い、移植可能なHSCを誘導することに成功した。さらに、胎生10日のHECを同様に培養することにより、HSCを誘導することにも成功した。一方、胎生9日のHECは、間葉系細胞株＋血管内皮細胞株との共培養によってもHSCに分化しない。HECを含む全ての胎仔細胞を間葉系細胞株と共培養するとHSCが誘導されることから、胎生9日のHECからHSCを誘導するためには、血管内皮細胞に加えて、それ以外の何らかの細胞が共存しなければならないと考えられる。胎生9日以前のHECとその起源となる前駆細胞を同定し、それらが実際にin vivoで受けているシグナルを明らかにするために、胎生8日および9日の傍大動脈内臓葉のsingle cell RNA-seq解析を行い、single cellレベルでの遺伝子発現情報から候補となる細胞集団を特定した。今後は、それらの細胞を単離してHSCへの分化誘導を行う予定である。この培養条件を確立することができれば、ES細胞からHSCへの分化誘導を実現できると考えている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究では、マウス胎仔からセルソーターで単離したHECをHSCに分化させる培養系を先ず確立し、次いで、マウスES細胞から分化誘導したHECをこの培養系に乗せることによりHSCに分化させる計画である。これまでに、(1)胎生11日のpre-HSCを特定のサイトカインだけでHSCに誘導できること、(2)胎生10日のpre-HSCを間葉系細胞株もしくは間葉系細胞株＋血管内皮細胞株との共培養によってHSCに誘導できること、(3)胎生10日のHECを(2)と同様の条件でHSCに誘導できること、(4)胎生9日のHECを含む胎仔細胞を間葉系細胞株との共培養によってHSCに誘導できること、を明らかにした。pre-HSCからHSCへの分化段階に必要十分なシグナルが同定され、pre-HSCの初期分化に必要なシグナルを同定するための実験系が整備された。さらに、胎生8日および9日の傍大動脈内臓葉のsingle cell RNA-seq解析により、(5)胎生9日以前のHECとその起源となる前駆細胞の候補となる細胞集団を特定した。以上のことから、計画は概ね順調に進んでいる。
Strategy for Future Research Activity	これまでにセルソーターで単離してきたHECとpre-HSCはそれぞれ均質な細胞集団ではないため、真のHECとpre-HSCを濃縮する必要がある。そのために、既に取得した胎生8～9日のsingle cell RNA-seqデータに加えて、胎生10日のAGM領域のsingle cell RNA-seq解析を行い、HECとpre-HSCの特異的なマーカー遺伝子を新たに探索する。候補となるマーカーに基づいてマウス胎仔から細胞を単離し、それまでに確立したHSC誘導培養系を用いてHSCに分化することを確認し、HECとpre-HSCが純化されたことを証明する。さらに、single cell RNA-seqのデータを用い、初期の前駆細胞からHECを経てpre-HSCに至るそれぞれの分化段階で活性化しているシグナル経路を推測する。これらの情報を基にしてHSC誘導培養系を改良し、無血清・無フィーダー細胞でのHSC誘導をめざす。同時に、ES細胞から分化誘導したHECのsingle cell RNA-seq解析を行い、胎仔から純化したHECとの遺伝子発現・シグナル活性化における違いを明らかにする。この情報を基にしてES細胞の分化誘導条件を適正化し、胎仔から純化した場合と同等の真正のHECを誘導する。このHECをHSC誘導培養系に乗せることで、HSCまで分化誘導できると考えている。
Causes of Carryover	計画通りに予算執行を進めたが、若干の残額が生じたため次年度に繰り越した。