2018 Fiscal Year Research-status Report
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18K06266
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
餅井 真 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 准教授 (90202358)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 傷表皮 / アフリカツメガエル / 尾部再生 / トランスクリプトーム / 分泌性シグナル因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
両生類の付属器官（四肢や尾部）の再生過程において、傷表皮(WE)およびその肥厚した組織である頂端部上皮キャップ(AEC)は重要なシグナルセンターとして働くと考えられるが、その詳細は解明されていない。本研究では、WE/AECから放出される分泌性シグナル因子を網羅的に同定し、その発現および機能を明らかにすることを目的としている。我々が作成したes1:egfpトランスジェニックアフリカツメガエルは、幼生尾部再生過程のWE/AECでegfpを選択的に発現するので、これを利用して単離したWE/AECの細胞を用いたトランスクリプトーム解析をおこなった。その結果をふまえ以下のように研究を計画した。
1)発現が確認された遺伝子のうちから分泌性シグナル因子に相当するものを選び出し、さらにその発現レベルが一定以上高く再生過程で変化するものを、WE/AECの機能を担う遺伝子候補とする。
2)同定した遺伝子候補について、尾部再生過程における発現のタイミングと場所を、RT-PCR法およびin situハイブリダイゼーション法で解析する。またそれらについて四肢再生過程における発現の解析をおこなう。
3)候補遺伝子をエレクトロポーレーションで過剰に発現させるか、あるいはCRISPR/Cas9システムを用いた遺伝子ノックアウトにより、それぞれの遺伝子の付属器官再生における機能を明らかにする。
本年度は、WE/AECで発現すると考えられる分泌性シグナル因子遺伝子を30個程度同定することができ、その一部についてはWE/AECにおける発現を確認した。また、遺伝子機能解析のためのエレクトロポーレーション法およびCRISPR/Cas9によるノックアウトの条件検討をおこなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
以下のようにおおむね計画通りに研究を進めた。
1) トランスクリプトーム解析の結果、尾部再生時のWE/AECで発現上昇すると予想される分泌性シグナル因子遺伝子を約30個同定した。発現レベルが比較的高いと期待される遺伝子について、ホールマウントin situハイブリダイゼーション法による解析をおこなった結果、8種の遺伝子について、幼生尾部再生時のWE/AECにおける発現を確認した。
2) 遺伝子機能解析のため、尾部表皮細胞へのエレクトロポーレーション法による遺伝子導入条件を検討した結果、高い頻度でgfp等のマーカー遺伝子を発現させることに成功した。
3) 遺伝子機能解析のためのノックアウト実験の条件検討をおこなった結果、tyrosinaseに対するsgRNAとCAS9を受精卵に導入し、高い頻度でアフリカツメガエルでアルビノ変異固体を得ることに成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在の研究を継続し以下のように研究を進める。
1) 幼生尾部での発現に加え、肢芽再生時における発現を解析し、我々が同定したWE/AEC分泌因子遺伝子が、肢芽の再生過程においても同様にWE/AECで発現するかどうか検討する。
2) エレクトロポーレーション法を用いて、WE/AECとなることが予想される表皮細胞に候補遺伝子の導入・発現を試みる。まず、神経線維の伸長等に阻害的に働くことが予想されるslit遺伝子の導入を試み、その神経伸長および再生への影響を検討する。
3) 候補遺伝子のノックアウト固体を、CRISPR/Cas9システムを用いて順次作成する。オタマジャクシ胚以降に発生したものについて、尾部切断後正常に再生するかどうか検討する。
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| Causes of Carryover |
ほぼ計画通りに研究を遂行したが、出張（学会発表および共同実験）の回数が見積もりより少なかったこと、および、遺伝子導入および発現解析のための消耗品の購入の一部を翌年に持ち越したため、若干次年度使用額が生じた。
次年度では、本来の請求額と合わせて、遺伝子発現および機能解析に必要とされる消耗品等の物品の購入等に当てる予定である。
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