2020 Fiscal Year Research-status Report
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18K06266
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
餅井 真 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 准教授 (90202358)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 傷表皮 / AEC / アフリカツメガエル / 尾部再生 / トランスクリプトーム / 分泌生シグナル因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
両生類の付属器官（四肢や尾部）の再生過程において、傷表皮が肥厚した組織である頂端部上皮キャップ(AEC)は重要なシグナルセンターとして働くが、その分子的背景は明らかになっていない。本研究では、AECから放出される分泌性シグナル因子(AEC因子)を網羅的に同定し、その発現および機能を明らかにすることを目標としている。我々が作成したes1:egfpトランスジェニックアフリカツメガエルは、幼生尾部再生過程のAECでEGFPを選択的に発現するので、これを利用して単離したAEC細胞を用いたトランスクリプトーム解析をおこない、その結果をもとに以下のように研究を進めた。
1)トランスクリプトーム解析の結果、約30のAEC因子遺伝子候補を同定した。さらに、in situハイブリダイゼーション解析の結果、7種の遺伝子が再生尾部AECで比較的強く発現することがわかった。
2) 再生肢芽における発現解析をおこなったところ、上記遺伝子のうち5個は尾部と肢芽のAECで共通して発現することがわかったが、残り2個は尾部AEC特異的であった。また、AEC因子として過去に報告されているFGF8は、肢芽AECに特異的であった。つまり肢芽と尾部とでAEC因子の構成に違いがあることがわかった。
4) CRISPR/Cas9法を用いて目的遺伝子への変異誘導を試みたところ、変異を持つ胚が数十%程度得られることがわかった。
5) 上記AEC因子の候補遺伝子について変異誘導個体を作製し、尾部再生における機能の検定をおこなった。
6) エレクトロポーレーションの条件検討をおこない、遺伝子を尾部表皮および、AECで発現させることに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
以下のようにおおむね計画通りに研究を進めた。
1) トランスクリプトーム解析の結果、ホールマウントin situハイブリダイゼーション法による発現解析および、尾部AECと肢芽AECとの発現比較について、論文発表をおこなった(Okumura et al., 2019)。
2) アフリカツメガエル は異質四倍体であり、ほぼすべての遺伝子についてLS2セット持つ。CRISPR/Cas9による両遺伝子の同時破壊の方法を確立した。
3) 同定したAEC因子候補遺伝子のうち発現レベルの高いものについて遺伝子破壊を試みた結果、TGFb1遺伝子を破壊した胚では尾部再生が進行しないことを発見した。
3)エレクトロポーレーションによる表皮への高効率遺伝子導入法をぼ確立した。マーカー遺伝子発現により表皮細胞の動態を観察するとともに、SLIT1を過剰に発現させると、AECへの神経繊維分布と再生が低下することがわかった。また、FGF受容体の必要性も示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在の研究を継続し以下のように研究を進める。
1)ノックアウトにより再生への影響が見られたtgfb1について、その影響の詳細を解析しすすとともに、受容体候補遺伝子に対する機能解析をおこない、結果を合わせて論文発表する。
2)Slit1についてエレクトロポーレーション以外の方法により再生における機能解析をおこなう。
3)各種FGF受容体(FGFR1-4)について傷表皮・AECにおける機能をノックアウト法により解析する。
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| Causes of Carryover |
ほぼ計画通りに研究を遂行したが、出張（学会発表および共同実験）の回数が見積もりより少なかったこと、および、一部実験（tgfb1のノックアウト実験個体の解析とtgfb受容体のノックアウト実験）を翌年度に持ち越したため次年度使用額が生じた。また、論文発表のための経費も必要であある。次年度では、これら遺伝子機能解析に必要とされる消耗品等の物品の購入等と成果発表のための費用と旅費に使用する。
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