2018 Fiscal Year Research-status Report
In vivo function analysis of Sox-partner factor complexes in cell fate switch
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18K06267
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| Research Institution | Kochi University of Technology |
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Principal Investigator |
蒲池 雄介 高知工科大学, 環境理工学群, 教授 (90263334)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 転写因子 / Sox / エピトープタグ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
胚発生過程における細胞の分化は、複数の転写因子がつくる複合体がスイッチ機能を果たすことによって進行している場合が知られている。Sox転写因子群は、このような機能を担う複合体を形成する中核因子の一つであり、その代表的な複合体としてES細胞やiPS細胞の幹細胞性と密接に関係したSox2-Oct4複合体があげられる。胚発生の過程では、様々な組み合わせのSox-パートナー因子複合体が、異なる分化状態の制御に重要な役割を果たしていると考えられるが、in vivoにおける複合体の分子構成（組合せ）とそれらの標的配列・標的遺伝子に関しては不明な点が多く残されている。本研究では、SoxB1-パートナー因子複合体の研究を通して、転写因子複合体がどのようなメカニズムで細胞分化スイッチとして機能するのかを明らかにすることを目的に実施する。
これには、まず複合体ごとのゲノムとの相互作用を詳細に調べる必要がある。近年ChIP-seq法(クロマチン免疫沈降法とそれに続く次世代型シーケンサーによるDNA配列の解読)が普及し、個々の転写因子についてはゲノム上での結合部位が判明しつつある。転写因子複合体が結合しているゲノム部位を調べる場合、まず一方の因子についてChIPを行った後、引き続き二つ目の因子のChIPを行う方法(re-ChIP)が最も直接的な方法となるが、これを行うにはそれぞれの因子に対する高品質な抗体が必要となるため転写因子複合体の研究はいまだに困難である。
そこで本研究では、まずゲノム編集により内在のSoxB1因子ならびにパートナー因子(Pax, POU因子)に異なるタグ配列を付加することで、特定の複合体をre-tag-ChIP（タグを利用した繰り返しのクロマチン免疫沈降）により高度に精製するを可能にする。本年度は、効率的にタグ配列をゼブラフィッシュゲノムへノックインする方法の開発を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
CRSPR-Cas9を利用して、効率的にタグ配列をゼブラフィッシュゲノムへノックインする方法の開発を行った。sox3遺伝子をノックインのターゲットとして条件検討を重ねたところ、CRSPR-Cas9をタンパク質-RNA複合体としてマイクロインジェクションに用い、さらに長鎖ssDNAを二本鎖 DNA 切断後の相同組換え修復(HDR)に用いることで、効率よくノックインが行えることが分かった。したがって、おおむね順調に研究は進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
確立することが出来たタグ配列を効率的にゼブラフィッシュゲノムへノックインする方法を用いて、paxならびにpou遺伝子群にタグ配列をノックインする。同時に、効率的にre-tag-ChIPを行う方法の検討をすすめる。
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