2019 Fiscal Year Research-status Report
In vivo function analysis of Sox-partner factor complexes in cell fate switch
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18K06267
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| Research Institution | Kochi University of Technology |
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Principal Investigator |
蒲池 雄介 高知工科大学, 環境理工学群, 教授 (90263334)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 転写因子 / Sox / エヒトーフタク |
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| Outline of Annual Research Achievements |
胚発生過程における細胞の分化は、複数の転写因子がつくる複合体がスイッチ機能を果たすことによって進行している場合が知られている。Sox転写因子群は、このような機能を担う複合体を形成する中核因子の一つであり、その代表的な複合体としてES細胞やiPS細胞の幹細胞性と密接に関係したSox2-Oct4複合体があげられる。胚発生の過程では、様々な組み合わせのSox-パートナー因子複合体が、異なる分化状態の制御に重要な役割を果たしていると考えられるが、in vivoにおける複合体の分子構成（組合せ）とそれらの標的配列・標的遺伝子に関しては不明な点が多く残されている。本研究では、SoxB1-パートナー因子複合体の研究を通して、転写因子複合体がどのようなメカニズムで細胞分化スイッチとして機能するのかを明らかにすることを目的に実施する。
本研究では、まずゲノム編集により内在のSoxB1因子ならびにパートナー因子(Pax, POU因子)に異なるタグ配列を付加することで、特定の複合体をtag-ChIP（タグを利用したクロマチン免疫沈降）により高度に精製する手法を確立する。さらに、ChIPを２段階繰り返して行う方法(re-tag-ChIP）により３者複合体を高度に精製することを可能にする。これまでの研究でssDNAをドナーにすることで効率的にタグ配列をゼブラフィッシュゲノムへノックインできること、さらに高い確率で生殖系列細胞でのノックインも起こることを見いだした。この手法を用いることでSoxならびにパートナー因子の遺伝子へのタグのノックインを迅速に進めることが可能になった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
CRSPR-Cas9を利用して、効率的にタグ配列をゼブラフィッシュゲノムへノックインする方法の開発を行った。sox3遺伝子をノックインのターゲットとして条件検討を重ねたところ、CRSPR-Cas9をタンパク質-RNA複合体としてマイクロインジェクションに用い、さらに長鎖ssDNAを二本鎖 DNA 切断後の相同組換え修復(HDR)に用いることで、効率よくノックインが行えることが分かった。さらに、ノックイン効率を高める長鎖ssDNAのドナー配列の構造を調べたところ、鎖の選択とホモロジーアーム長が重要な要因であることを見いだした。この至適化された方法を用いて、Soxならびにパートナー因子の遺伝子群へのタグのノックインを進めている。したがって、おおむね順調に研究は進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
確立することが出来たタグ配列を効率的にゼブラフィッシュゲノムへノックインする方法を用いて、sox, paxならびにpou遺伝子群にタグ配列がノックインされたゲノム編集ゼブラフィッシュを確立する。同時に、効率的なtag-ChIP 法、さらにre-tag-ChIP法を行う方法の検討をすすめる。
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