AUG-UAAを介したリボソーム停滞のホウ素栄養制御機構

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K06278
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 田中 真幸 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 特任助教 (80546292)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: リボソーム / ｍRNA分解 / uORF / ホウ素

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、開始コドン-終始コドンという、アミノ酸をコードしない配列AUG-UAA配列を介してどのようにホウ素依存的にリボソームが停滞するのかを解明し、これまでにない新奇のリボソーム停滞制御機構を明らかにすること及び、これらの発現制御に関わる因子の同定を目的とした。
AUGUAA上で停滞しているリボソームmRNA複合体を精製し、Cryo-EMによるリボソームの構造解析行った。これまでの予備実験では、その分解能は低く、7～8 Aであったため、より詳細なリボソームの構造を解析することが難しかった。そのため、初年度では、リボソームの精製法を検討した。その結果、リボソームの粒子数を増やすことに成功した。さらに、最新の画像処理技術を用いることで、分解能を上げることが可能となり、分解能は3 Aまで達した。その結果、リボソームの構造をより詳細に明らかにすることが可能となった。
AUG-UAA配列を介したホウ素依存的なリボソーム停滞に伴うmRNA分解を制御する因子の同定のため、これまで、5’UTRを含むNIP5;1 にGFPを付加させた形質転換植物を用い、変異原処理した植物のGFP蛍光を指標とし、NIP5;1のホウ素依存的な発現制御に関わる遺伝子の選抜を行い、2つの候補遺伝子を同定した。それらの原因遺伝子は、それぞれmRNA分解と翻訳に関わる遺伝子であると推定された。その内、mRNA分解に関わる遺伝子について、相補実験を行い原因遺伝子を特定した。さらに、これらの原因遺伝子の欠損株を取得し、NIP5;1のmRNA蓄積を調べた結果、野生型に比べてmRNAの蓄積が優位に上昇し、それらの欠損株では、ホウ素応答性が弱くなっていた。この遺伝子は細胞質に局在し、根全体で発現していることが明らかとなった。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

当初の予定よりも早くリボソームmRNA複合体の精製系を確立できたこと、また画像解析処理技術が各段に上がったことにより、当初予定していた分解能よりも高い分解能を得ることができた。そのため、２年目以降で予定していた、構造解析を前倒し、現在解析を進めている。
リボソーム停滞及びmRNA分解に関わるターゲット因子の同定に関して、初年度で、原因遺伝子を特定することができ、その機能解析は順調に進んでいる。また、新たに１つ変異株を同定し、次世代シークエンス解析を行っており、現在マッピングにより候補遺伝子を同定を行っている。

Strategy for Future Research Activity

リボソームmRNA複合体を精製系が確立できたので、次年度では、ホウ素が関与している作用点の特定のため、光活性化ボロン酸(photoaffinity boronic acid：PABA)を用いてAUG-UAAで停滞しているリボソームのホウ素の結合部位を推定する。PABA存在下でリボソームの精製を行い、標的タンパク質の特定を行う。
リボソーム停滞及びmRNA分解に関わるターゲット因子の機能解析と変異株の原因遺伝子の特定を引き続き行う。

Causes of Carryover

（理由）
当初の予定よりも早くリボソームmRNA複合体の精製系を確立できたため、リボソーム関連試薬の購入金額が予定よりも抑えられた。
（使用計画）
次年度では、PABA存在下でリボソームの精製を行う予定であり、未使用額はその経費に充てることにしたい。