2019 Fiscal Year Research-status Report
光合成電子伝達に必須なチトクロムbc複合体を機能相補する新規電子伝達酵素の同定
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18K06295
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| Research Institution | Kanagawa University |
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Principal Investigator |
永島 賢治 神奈川大学, 付置研究所, 研究員 (80264589)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 光合成電子伝達 / 紅色光合成細菌 / シトクロム / 遺伝子操作 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では光合成や酸素呼吸の電子伝達反応において必要不可欠なキノールの酸化と水溶性電子伝達タンパクの還元を行う成分であるシトクロムb6f/bc複合体を機能相補する新規キノール酸化/水溶性チトクロム還元酵素の生理・生化学的同定を目的としている。紅色光合成細菌においてこのような機能を果たすと推定された膜貫通タンパク質複合体にET1と仮称を付し、前年度に引き続き、細胞からの抽出と単離・精製を進めた。この精製標品を変性および未変性状態でゲル電気泳動解析（SDS-PAGEおよびBlue-Native PAGE）したところ、ET1複合体は遺伝子情報から推定された通り、約24 kDaのc型シトクロムと38 kDaの鉄-硫黄（FeS）タンパク質、およびキノール酸化能を持つ42 kDaの膜貫通タンパク質の３つから成る複合体であることがあらためて示された。さらに、これら３つのタンパク質の推定アミノ酸配列に基づく抗体をそれぞれ作製し、免疫学的な検出（ウエスタン・ブロッティング）も試みている。精製標品の酸化還元滴定を行うと、中点電位が+194 mVおよび+358 mVの２種類の成分が、およそ1:3の比で検出され、後者の成分は555 nmにα-吸収ピークを持つc 型ヘムであることが確認された。これらのことは、ET1複合体がb6f/bc複合体を機能相補しうることをさらに強く裏付けている。また、シトクロムb6f/bc複合体とET1の２重欠損株の継代培養から光合成生育が可能なサプレッサー変異株が見い出され、第３のキノール酸化/水溶性チトクロム還元酵素発見の可能性も出てきている。以上、光合成や呼吸の電子伝達経路が単一かつ閉鎖的なものではなく、他の経路との重複を含めた複雑なネットワークとなっていることが、前年度から引き続き、強く示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初予定していた、ヒスチジンタグ導入による新規キノール酸化/水溶性シトクロム還元酵素（ET1）の精製は、Ni-カラムへの吸着が見られなかったため、イオン交換カラムクロマトグラフィー等を適用した従前の方法で引き続き行った。ET1を構成すると予想される３つのタンパク質の同定は、エドマン分解法やマススペクトル解析などに加え、推定アミノ酸配列に基づき作成した抗体を用いた免疫学的手法を取り入れた。さらに、シトクロムb6f/bc複合体とET1の２重欠損株のサプレッサー変異株において新たに推定された第３のキノール酸化/水溶性チトクロム還元酵素についても、ET1と同様に精製・同定を試みた。当初は予想していなかったこれら新規電子伝達成分の存在も考慮に入れ研究を進めていく必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
基本的に当初計画に従って研究を続行する。高収率・高純度に得られるようになった新規キノール酸化/水溶性シトクロム還元酵素（ET1）の分光測定により、機能解明が大きく進展することが期待される。また、構成するサブユニットタンパク質の同定のため、各タンパクを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的実験も行う。
光化学反応中心に対する電子供与体として働く水溶性シトクロムcの同定も、精製光合成膜標品との再構成実験や欠損変異株の作成を通じて、さらに明確にする。ET1からの電子受容の可能性についても明らかにする。
第３のキノール酸化/水溶性チトクロム還元酵素についても機能の確認と精製・同定を試みる。
以上の研究項目の推進により、光合成電子伝達ネットワークの全貌を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
当初予定した実験内容が一部変更されたことにより、使用予定の設備備品の一部が購入不要となり、かつ消耗品（抗体など）購入が増大したことにより、差し引きとして繰り越しが発生した。ただし研究はほぼ予定通り進行しているので、次年度繰越分は新たに必要となった消耗品の購入や論文の校閲・投稿用に充当する。
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