2018 Fiscal Year Research-status Report
低ノイズlncRNA検出システムの開発と複合体分析による分化スイッチ機構の解明
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18K06317
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| Research Institution | Toho University |
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Principal Investigator |
川田 健文 東邦大学, 理学部, 教授 (30221899)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
村本 哲哉 東邦大学, 理学部, 講師 (10612575)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | lncRNA / 細胞性粘菌 / STAT / イメージング / 形成体（オーガナイザー） |
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| Outline of Annual Research Achievements |
長鎖ノンコーディングRNA (lncRNA)は多様な制御メカニズムで生体内の多様な機能を司っていることが明らかになってきたが、機能について詳しく調べられたlncRNAのほとんどは核内に存在するlncRNAであり、細胞質に存在するlncRNAについてはその機能まで詳しく調べられたものは限られている。申請者らは、真核多細胞微生物である細胞性粘菌の細胞質に存在するlncRNAである dutA RNAが、発生におけるオーガナイザー（形成体）領域で中心的なシグナル分子として機能する転写因子STATaの活性を調節することで未分化状態を維持していることを明らかにしてきた。
本研究では、発生におけるdutA RNAの機能を詳しく知るために、発生時期に依存した経時的な局在について解析して正確に把握し、それを補完する目的での生体組織中でdutA RNAの動態を知るために可視化を試みることとした。今までの実験において、核内でのdutA遺伝子からの転写を蛍光スポットとして捉えることには成功したが、検出に用いたGFPのノイズが高くてdutA RNAの動態を追跡するには不向きであった。そこで本研究では、ノイズの殆どない或いは極めて低い新規のRNA動態検出法を立ち上げてdutA RNAのダイナミズムを把握することを目指した。また、同時にlncRNAの機能解析には欠かせないRNA結合タンパク質を同定し、dutA RNA－タンパク質複合体組成を分析することで、dutA RNAがどのような機序でオーガナイザーから消失するかを解明し、細胞質lncRNAの組織特異的な消失によるダイナミックな分化スイッチのメカニズムを提唱することを最終的な目標とした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2018年度は上手く進捗しなかった部分と予想以上に進捗した部分が混在し、総じておおむね順調に進展していると言える。
まず、進捗しなかった部分はイメージング技術の開発である。今までのシステムではノイズが高くて使えなかったことから、MS2-GFPを低レベルに発現する株を選抜することに成功した。この株を用いてノックイン株のdutA RNA分子そのものをRNA FISHで、そこに結合するMS2-GFP融合タンンパク質を免疫染色で共局在を調べた。その結果、以前の株よりノイズは軽減して改善し、RNAとGFPが共局在しているところも見られた。しかしながら、依然として局在が一致しないノイズが見られた。その他の試みとして行ったスプリット蛍光タンパクを用いた解析では、上手くシグナルが見られなかった。
一方で、その他の研究計画は予想以上に進展した。まず、コントロールとしての内在dutA RNAの経時的な局在変化をSTATaの局在と共に正確に記述した。その結果、dutA RNAは今まで知られていた以上に発生とともに局在を劇的に変化させることを見出した。また、STATaとの共局在はほとんど見られなかった。
dutA RNA結合タンパク質の精製では、ChIRP法によってある程度複合体の精製が可能であったが、精製量が不足してノイズを完全に除くことができなかった。その改善策として、イメージング用に作製したノックイン株をそのまま用いてMBP-trap法で精製を試みた。その結果、多くのタンパク質を高純度に精製出来、そのうち４つのタンパク質について質量分析によって同定に成功した。また、これらのタンパク質にタグを付加してRNA免疫沈降 （RIP実験）を行った結果、dutA RNAが特異的に検出されたことから、これらのタンパク質が実際にdutA RNAに結合することが確認された。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究で提案した方法でdutA RNAの動態を観察することは容易ではないと思われる。しかしながら、目印となるMS2-GFPタンパク質を細胞内で均一に発現させることでS/N比が改善するという報告がある。その報告で用いられているベクターを入手し、既存のノックイン株に導入することで、dutA RNAとの共局在が見られるかを観察する。充分な共局在が見られれば、その株を用いてイメージングを行う。
dutA RNAがどの様にSTATaの活性化状態に作用しているかについて調べるために、新規のノックアウト株、過剰発現株を作製した。これらの表現型を現在解析中であり、予備実験のデータとしてSTATa関連シグナル遺伝子のmRNAの量が変動することを見出した。そこで、網羅的に変動するmRNAを同定する目的で、新学術領域先進ゲノム支援の協力を得て、現在これらの株から得られたRNAサンプルを使ってRNA-seqを依頼中である。今後、これによって得られた遺伝子がどの様な振る舞いをするかについて解析する。特に、遺伝子の破壊株作製やmRNAとdutA RNAとの共局在の様子を調べる。
dutA RNA結合タンパク質の精製では、ノックイン株のようにMS2結合部位が24回反復しているような大きなタグではなく、dutAの内部にMS2結合部位を3コピーのみ挿入した発現ベクターを用いる方が、量的にも質的にもより多くのタンパク質を精製出来ることがわかった。これによって、今までに同定した４種類以外のdutA RNA結合タンパク質の同定も行う。同じようにRIP実験による確認を行うほか、2018年度に同定された4種類についてもin vitroでdutA RNAに結合する能力があるかどうかをpull downやゲルシフト法などを用いて確かめる。また、それぞれの遺伝子の機能やdutA RNAとの共局在についても調べる
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| Causes of Carryover |
当初の予定ではほぼ過不足なく使い切れる予定であったが、dutA RNA結合タンパク質の精製と同定にさほど時間がかからなかったために要する費用が少なくて済んだことが主な理由である。それと同時に、精製法を改善することで、より多くの種類のdutA RNA結合タンパク質を精製できたために、それらを同定する作業を2019年度に回し、そちらに費用を充てることの方が得策と考えられた。
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