2019 Fiscal Year Research-status Report
抗微生物、細胞障害、細胞膜透過－ヒストンが配列内に秘めた多様な作用とその活用
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18K06319
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| Research Institution | Toho University |
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Principal Investigator |
岩室 祥一 東邦大学, 理学部, 教授 (70221794)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小林 哲也 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (00195794)
菊山 榮 早稲田大学, 教育・総合科学学術院, 名誉教授 (20063638)
蓮沼 至 東邦大学, 理学部, 准教授 (40434261)
中野 真樹 信州大学, 医学部, 研究員 (20646195)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ヒストン / 細胞膜透過ペプチド / 抗菌 / 細胞毒性 / 細胞障害性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒストンは、真核生物のヌクレオソームを構成する核内タンパク質として知られている一方、核外や細胞外にも存在する。前年度はヒストンのサブタイプの一つであるH3が植物病原性微生物に対しても抗菌性・細胞毒性を示すことを立証し、また抗微生物作用と細胞毒性の責任領域が分子内で異なることを明らかにした。そこで今年度はそれぞれの領域の機能を詳細に調べるため、ヒストンH3を4分割したペプチドに対する大腸菌毒素リポ多糖（LPS）と黄色ブドウ球菌毒素リポテイコ酸（LTA）へ結合能を検出する系と、細胞障害時に炎症性サイトカインmRNAの変動を検出する系を作製した。前者においては細胞毒性領域のみ細菌毒素への結合が検出されなかった。後者においては全長ヒストンH3が炎症性サイトカインのmRNA発現を有意に誘導する一方で、細胞毒性領域ではなく抗菌活性を示す領域が発現を誘導するという結果を得た。
一方、リンカーヒストンであるH1は生物種によって多様なアミノ酸配列を示す。そこでウシヒストンH1の動物病原菌および植物病原菌に対する抗菌作用の検証を行ない、いずれに対しても抗菌作用を示すことを明らかにした。また、哺乳類細胞に対する毒性も検証したところ、他のヒストンサブタイプと比べて毒性は低いことが明らかとなった。
さらに、ヒストンは低濃度においては細胞膜透過能を示すことが知られており、代表者らはヒストンH2Bが大腸菌の細胞膜透過を行うことを過去に報告している。このときの知見をもとにヒストンH2Bのアミノ酸配列をもとに細胞膜透過能が予測される配列を絞り込み、細胞膜透過を観察留守とともに、この配列に炎症性サイトカインの転写因子の抑制配列をつなぎ、細胞内に導入することで炎症性mRNA発現の抑制を行うこととした。現在、炎症性サイトカインのLPSによるmRNAの発現誘導系を作製したところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究はほぼ当初の計画通りに進み、成果の一部は関連学会で複数の発表を行ったが、一部についてはコロナウイルス感染症拡大の影響を受け、発表ができなくなった。また、年度末から1ヶ月程度、同感染症の影響で研究が止まってしまった。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヒストンH3については、in vitroの実験はほぼ終了しているので、投稿論文の執筆を進める。また、全長ヒストンH3のin vivoでの毒性の検証を行う。投与のためのヒストンH3が高価であることから、安価なヒストンH3を購入したところ、純度が低いことが示されたため、これまで使用していたものと同じものを使用する。ただし、当初計画していたカイコへの投与の場合、ヒストンH3が大量に必要になるため、同じ節足動物であるスジエビでの実験が可能かどうかも検証する。
ヒストンH4にもH3と同様の抗菌活性ならびに細胞毒性があると考えられる。そこで、ヒストンH4の全長を5分割したペプチドを作製し、それぞれの抗菌活性と細胞毒性を検証することにより、H3と同様にそれぞれの活性が異なる領域に由来するかどうかを微量液体希釈法やMTT assay、走査型電子顕微鏡観察法等により、検証する。
ヒストンH2B分子中の細胞膜透過配列のN末端もしくはC末端、あるいは両端に「積荷」として細胞内に導入したい配列を付加して培養細胞に添加し、細胞に機能付加あるいは機能抑制を行う。ヒストンH3については細胞膜透過能が報告されているが、その領域は未解明である。細胞膜透過には塩基性アミノ酸に富む領域が必須であることに基づき、H3配列中からその領域を大まかに予測して合成したペプチドを蛍光標識してその膜透過作用を検証する。
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| Causes of Carryover |
次年度使用が生じた最大の理由は、本務の日程との重複により学会への参加が少なかったことと、2月以降、コロナウイルス感染拡大に伴う商品入荷（合成ペプチド）の日程が不明であったことから、科研費での購入を控えたためである。次年度に生じた分はその合成とカイコを中心に、物品（消耗品）の購入と論文執筆における英文校正等に充当する。
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Research Products
(7 results)
