2019 Fiscal Year Research-status Report

Molecular mechanisms underlying formation of intestinal stem cell niche during amphibian metamorphosis

Research Project

Project/Area Number	18K06320
Research Institution	Nippon Medical School
Principal Investigator	岡敦子日本医科大学, 医学部, 教授 (50175254)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2022-03-31
Keywords	消化管 / 幹細胞 / ニッチ形成 / 甲状腺ホルモン受容体 / 変態 / Hippoシグナル伝達経路 / アフリカツメガエル
Outline of Annual Research Achievements	両生類変態期の小腸では、甲状腺ホルモン（TH）の作用により、Ror2を特異的に発現する予定幹細胞が成体幹細胞へと脱分化し、その周囲にニッチが形成される。この幹細胞ニッチ形成の分子基盤を解明するため、アフリカツメガエルの小腸を実験材料として研究を進めている。本年度は、昨年度に引き続きTH受容体（TRa、TRb）の免疫組織化学的解析を行った。予定幹細胞の脱分化にはTRaが、脱分化後の幹細胞の活発な増殖にはTRaとTRbの両方が、幼生固有細胞のアポトーシスにはTRbが、TH存在下でのヒストンのアセチル化促進によるエピジェネティックな変化を介して関与することを示す結果を得、報告した。また、Hippoシグナル伝達経路に関わる遺伝子群の発現解析を進め、現在までにYap1の他に、Lats1,2、Stk3,4等の発現が変態期にTHにより変動することを観察した。Yap1についてはタンパク質の細胞内分布を調べるために免疫組織化学的解析も行い、幹細胞出現前では幼生上皮細胞の核で散在的に、出現後は増殖中の幹細胞自身の核とその近くの繊維芽細胞の核にYap1が局在することを明らかにした。Hippo経路が不活性化するとYap1は核移行して標的遺伝子の転写を促進することが知られており、幹細胞の発生にYap1が関与することが予想される。さらに、哺乳類成体小腸のニッチを構成するtelocyte（上皮近くの繊維芽細胞）のマーカーであるFoxl1の発現が、カエルの小腸では変態期にTHにより誘導されることを見出した。このことは、哺乳類小腸共通の幹細胞ニッチ形成機構にFoxl1発現細胞が重要な役割を果たしていることを強く示唆している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason Ror2発現細胞で特異的にGFPが発現するように作製したトランスジェニック（Tg）カエルを使うことにより、予定幹細胞を同定することが容易になったため、本研究の細胞組織化学的解析は計画通り進んでいる。また、Hippo経路が幹細胞ニッチ形成に果たす役割を明らかにしていくため、独自に開発した小腸の培養系を使い、Yap1の機能阻害物質を添加する予備実験にも着手した。条件設定はほぼ整い、研究はおおむね順調に進んでいる。
Strategy for Future Research Activity	本年度の研究成果より、Yap1が幹細胞の発生に関与することが予想されたため、来年度はYap1のin vitro での機能解析を進める。Yap1の機能阻害培養実験を行い、Yap1が予定幹細胞の脱分化や幹細胞の増殖にどのような影響を及ぼすのかを免疫組織化学的解析により明らかにする。また、Tgカエルを使って、脱分化前の予定幹細胞の核にYap1が局在するか否かについても調べる。また、Foxl1が幹細胞ニッチ形成に重要な役割を果たしていることが本年度の研究成果より示唆されたため、今後、Foxl1にも焦点をあててニッチ形成機構の解明を進める予定である。まず、Foxl1が繊維芽細胞特異的に発現することを確かめ、Foxl1発現細胞と幹細胞ニッチ形成との時間・空間的関連を明らかにする。幹細胞出現時にその近くに密集する繊維芽細胞特異的にFoxl1の発現が検出された場合には、哺乳類小腸のFoxl1発現細胞が分泌することが報告されているシグナル分子（幹細胞増殖に必須なWnt2b等）の発現の有無について調べる。また、これまで変態期小腸の幹細胞近くの繊維芽細胞で一過性に発現が上昇することが報告されているシグナル分子（BMP4、Gli2、HAS2、Yap1等）とFoxl1との関連についても明らかにしていく。