2019 Fiscal Year Research-status Report
Role of CD34+ endothelial cells in in vivo testis formation and in vitro reconstruction of testis
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18K06322
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| Research Institution | Kumamoto Health Science University |
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Principal Investigator |
安部 眞一 熊本保健科学大学, 保健科学部, 教授 (90109637)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 精巣形成 / 精細管様構造 / 3次元培養 / 再凝集 / KSR / 間質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
哺乳類の精巣は、精細管と間組織から成る。その構造形成機構を調べるため、我々は生後マウス精巣を解離・再凝集させ、コラーゲン内3次元培養系にKSRを添加することにより、ほぼ完全な精巣再構築に成功した(Zhang et al., 2014)。さらに、精巣間質に存在するCD34+細胞, p75+細胞, 筋様細胞が、培養7日目には外側から筋様細胞、p75+細胞、CD34+細胞と3層構造を再構築することから、CD34+細胞やp75+内皮細胞が精細管再構築に重要であることを示した(Abe et al., 2017)。我々は、精巣索・精細管の形成における内皮細胞の役割について、in vivo とin vitroの両面から解析することを目的とする。
本年度は、胎児型ライデイッヒ細胞（fLyd）のみにEGFPを発現するマウスの精巣を用いて再凝集培養の過程をタイムラプス共焦点蛍光顕微鏡で観察した。０日目にfLydは密に集合しているが、１日以内に集合がばらけ始め、個々の細胞は活発に動き始める。やがて１週間以内にfLydは再凝集体のあちこちで小さな集合体を形成する。PDGF受容体の阻害剤である tyrphostin(Tyr)を加えると、fLydの動きが不活発になり、新たな集合体も形成しなくなる。PDGF受容体はCD34+細胞やp75+細胞に発現しているので、これらの結果はCD34+細胞やp75+細胞がfLydの動きに影響を与えていることが示唆される。また、再凝集培養においてfLydがCD34+細胞やp75+細胞の集合体の中に集合するのは、chemotaxisによるものかどうか調べるために、fLydをcell sorterによって分離し、transwell assayを行ったところ、10% fbs入りの培地に対して走化性を示した。今後、誘引物質について調べる予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
in vivoの実験で、胎児~生後マウス生殖巣・精巣におけるCD34陽性細胞の系譜解析を行うため、 tamoxifen(TAM)誘導型のCre酵素をCD34promoterの制御下で発現するマウス(CD34 -Cre ERT)をレポータ―マウス:R26R-H2B-mCherry (loxP) と交配させ、TAMを母親に注射して得られた胎児を調べたが、TAMの量や注射回数等をいろいろ変えてもCD34+細胞にCherryタンパク質の発現を確認することはできなかった。CD34ノックインマウスはCD34のpromoter活性が弱い可能性が考えられたので、CD34+細胞と密接な関係にあるp75+細胞のノックインマウスを連携研究者に作成して頂き、mCherryマウスと交配させTAMを注射したがp75+細胞にCherryタンパク質は発現しなかった。TAMの量を増やすと死産が多くなり、また生まれた子供にTAMを注射したり飲ませたりもしたが、結果は同じであった。
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| Strategy for Future Research Activity |
1)In vivoの実験： CD34-CreERTマウスやp75-CreERTマウスを用いた細胞系譜解析がうまくいかなかったので、p75-CreERTマウス（ヘテロ）同士を掛け合わせてp75遺伝子のノックアウトの作成を試みたところ、免疫染色でp75の発現が見られないマウスが得られた。今後、このノックアウトマウスの精巣での表現系について解析を行っていく予定である。
2)In vitroの実験: 再凝集培養においてfLydがCD34+細胞やp75+細胞の集合体の中に集合するメカニズムを探るため、引き続き、再凝集培養においてfLydのchemotaxisについて調べる。また、integrinやそれに対する阻害の効果についても調べる予定である。
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| Causes of Carryover |
翌年度分として請求した助成金と合わせて、cell sorterやtranswell assay等の消耗品経費として使用する予定である。
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