2018 Fiscal Year Research-status Report
The analysis of the function of cerebellar neural circuitry in fear conditioning
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18K06333
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
清水 貴史 名古屋大学, 生物機能開発利用研究センター, 准教授 (50324760)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 小脳 / 神経発生 / ゼブラフィッシュ / 顆粒細胞 / 恐怖応答 / 条件付け |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、恐怖を伴う情動における小脳神経回路の役割を明らかにすることを目的としている。ゼブラフィッシュをモデル動物として小脳神経回路の恐怖条件付けにおける役割の解明を目的とした。小脳を含む神経回路の活性をモニターあるいは制御する遺伝子改変フィッシュ(Tg)を作製した。プルキンエ細胞、小脳顆粒細胞、全脳の神経細胞に発現するエンハンサー/プロモーターを使用した。活性をモニターする系統としてGCaMP6に加え、光照射とカルシウム濃度によって発色が変化するCAMPARIを発現するTgを得た。活性をコントロールするTgとしては、これまでのChRWR、ArchTに加え、GtCCR4やアニオンチャネルGtACR1/2などを作製した。これまでの研究で、生後20日前後のゼブラフィッシュを用いて条件刺激としてLEDライトの消灯、無条件刺激として電気ショックを行い、条件反応として心拍数の変化を測定する恐怖条件付け学習の実験系を樹立した。小脳が古典的恐怖条件付けに関与していることを明らかとし、条件反応の獲得に従って反応する小脳内ニューロンを同定した。特定の脳領域に光照射を行い、光遺伝学ツールを活性化することよって神経活動を制御するシステムを導入した。また、光遺伝学ツールがゼブラフィッシュで有効に機能するかを確認するために仔魚を用いたアッセイ法を構築した。成魚を用いた回避学習のシステムを構築するために、狭い通路を通じて往来できる2つのコンパートメントに分割された水槽に電極と緑色LEDを付けた装置を作製した。電気ショックとLED点灯を組み合わせたパラダイムで回避学習を調べたところ、小脳顆粒細胞やプルキンエ細胞をボツリヌス毒素で機能阻害した成魚において学習個体の割合が低下していた。これらの魚では、運動機能に異常は見られなかった。以上のことから、回避学習に小脳が重要な働きをしていることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画書に記載した事柄のうち、以下のように研究の進展が見られた。
本研究に使用する遺伝子改変フィッシュ(Tg)の作製した。神経活動をモニターするTgとしてCAMPARIを神経細胞に発現するTgを作製した。神経活動を制御するTgとして、これまでのChRWR、ArchTに加え、GtCCR4やアニオンチャネルGtACR1/2などを作製した。さらに、これらの光遺伝学ツールがゼブラフィッシュで機能するかを確認するために仔魚の遊泳行動を指標としたアッセイ方法を構築した。パターン照射装置を用いて、ゼブラフィッシュ仔魚の限定された脳領域（後脳）に適切な波長の光を照射することによって誘発される遊泳行動をモニターする。ゼブラフィッシュ仔魚を用いた恐怖条件付け学習における小脳の役割を解析するために、ボツリヌス毒素による神経阻害に加えてニトロレダクターゼを小脳神経細胞に発現するTgを作製した。このTgにメトロニダゾールを投与することによって細胞死を起こすことを確認した。成魚を用いた回避学習（オペラント条件付け）のシステムを構築するために、狭い通路を通じて往来できる2つのコンパートメントに分割された水槽に電極と緑色LEDを設置した装置を作製した。電気ショックとLED点灯を組み合わせたパラダイムで回避学習を調べたところ、小脳顆粒細胞やプルキンエ細胞をボツリヌス毒素で機能阻害した成魚において学習個体の割合が低下していた。これらの魚では、運動機能に異常は見られなかった。以上のことから、回避学習に小脳が重要な働きをしていることが明らかとなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の実験を継続して行う。
すべての小脳顆粒細胞の活性を阻害したゼブラフィッシュ(cbln12プロモーター)や小脳プルキンエ細胞(aldocaプロモーター)を阻害した魚での恐怖条件付け学習の実験を行う。学習過程で活動が上昇する小脳ニューロンがどのような細胞であるかを解析する。また、新たに作製したTgにおいて、光遺伝学ツールが有効に使用できることを光刺激による遊泳行動の誘発によって確認する。回避学習における小脳の役割を解析するため、小脳神経を阻害した魚で実験を行う。さらに当研究室で作成された変異体(reelin、fat2など)を用いて回避学習実験を行い、恐怖応答における小脳の役割を明らかとする。
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| Causes of Carryover |
当年度に購入予定であった行動解析ソフトに代替するものを導入したために当該助成金が生じた。翌年度の古典的恐怖条件付け学習の実験に必要な消耗品の購入に使用する。また、光遺伝学ルールの導入並びトランスジェニックフィッシュの組織学的解析に必要な試薬を購入する予定である。
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