2018 Fiscal Year Research-status Report
Neuroepigenetic regulation of gene expression by DNA topooisomesase IIbeta
| Project/Area Number |
18K06349
|
|---|
| Research Institution | Okayama University |
|---|
Principal Investigator |
宮地 まり 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (50349255)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | 神経細胞分化 / 核内構造 / 遺伝子発現制御 / 神経特異的遺伝子 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
神経細胞分化過程での神経特異的遺伝子の発現誘導に重要なDNAトポイソメラーゼIIβ (top2b)に着目し，その個体レベルでの解析をモデル生物メダカを用いて行なった． メダカTop2b遺伝子のノックアウトを行うため，ガイドRNAを設計し，受精卵へのマイクロインジェクションを行なった．3日胚でT7 endonuclease assayにより切断効率を確認した．その後，マイクロインジェクションを行なった個体を1 cm以上になるまで育てて，尾びれを用いてgenotypingを行うことによりG0個体の作成，選択を行なった．得られたG0個体に野生体を掛け合わせることによりF1ヘテロ変異体を作出した．得られたF1ヘテロ変異体の変異領域をPCRで増幅し，クローニングを行なった．得られたクローンのinsertをcolony PCRで増幅し，どのような変異が入っているかを調べた．その結果，修復のされ方の違いにより同じG0の個体から異なる変異をもった個体が得られたことが分かった．それぞれの変異個体を見分けるオリゴDNAを設計し，以後PCRによる変異個体の選択に用いた．変異個体を選択，維持しながら野生体を掛け合わせることにより，F3変異体を作出した．その過程で，ヘテロ変異体同士を掛け合わせたが，ホモ変異体は得られなかった．作出されたF3ヘテロ変異体のうち，Top2b活性中心に変異を導入し，frame-shiftにより，途中までの配列しかないヘテロ変異体の全脳のRNA-seq解析を実施した．得られた結果を解析中である．
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
おおむね計画どおりに進んでいる．
|
| Strategy for Future Research Activity |
他の変異個体もRNA-seq解析を行い，行うべき行動実験を選択する．
|
| Causes of Carryover |
外注でRNA-seq解析を行うにあたりシークエンスのローデータ取得までを外注し，解析は自前で行なったため解析費が安く上がったため，次年度使用額が生じた．研究の進展によりさらにRNA-seq解析が必要になったため，今年度の外注RNA-seq解析のシークエンスデータ取得に当てる予定である．
|
