2019 Fiscal Year Research-status Report
A study on the participation of postsynaptic importin in synaptic plasticity.
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18K06467
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
板倉 誠 北里大学, 医学部, 准教授 (30398581)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小寺 義男 北里大学, 理学部, 教授 (60265733)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | インポーチン / 核内輸送 / 転写制御因子 / シナプス伝達 / 定量プロテオーム解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
記憶や学習が成立するためには、神経細胞が長期的に変化する必要がある。この長期的な変化には、神経細胞間の連結部位であるシナプスから、情報が核内へと伝達されることが必須である。申請者は、細胞質から核内へとタンパク質を輸送するインポーチン beta1がポストシナプスに存在することを見出しており、インポーチン beta1によるシナプスから核内への情報伝達機構の解明を目的として研究を行っている。
前年度は、インポーチン beta1が核内へと輸送している転写制御因子として、共免疫沈降法を用いてRogdi homologを同定した。本年度は、通常の共免疫沈降法にタンパク質架橋処理を加えることで、新たに2つの転写制御に関わるタンパク質 Transcription And Export Complex 2 Subunit (Eny2)とProbable global transcription activator SNF2L1を同定することができた。Eny2は、脊髄小脳変性症の原因タンパク質の1つと複合体を形成する。また転写を制御するだけでなく、RNAの核外への輸送にも関与しており、非常に興味深い。SNF2L1はSWI/SNF ファミリーの1つでクロマチンの再構成に関与しているタンパク質であるが、シナプス膜直下のシナプス後肥厚部での存在が報告されている。
また、神経活動に依存して核内へ輸送が起きるには、何らかのタンパク質に対する翻訳後修飾に変化があることが強く示唆される。そこで本年度は、定量リン酸化プロテオーム解析の条件検討も行った。その結果、マウス脳サンプルから数千種類のリン酸化部位を同定することができた。その中にはインポーチンファミリーや様々な転写制御に関わるタンパク質が含まれており、今後、定量解析を進め、神経活動に依存して変化するリン酸化部位の同定を行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前年度と同様にインポーチン beta1に結合するタンパク質の同定を行った。インポーチンファミリーのような輸送タンパク質と積み荷となるタンパク質は、結合と解離を繰り返す必要があるため、タンパク質間の結合はそれほど強固ではないと考えられる。そこで本年度は、ホルムアルデヒド処理によってタンパク質間を架橋した後、免疫沈降を行う実験方法を試みた。神経細胞のモデルであるPC12細胞を用いたところ、これまで明らかになっていなかったインポーチンファミリー間の結合やインポーチン beta1と転写を制御するタンパク質との結合を見出せた。今度は、マウス脳スライスを用いて、同様の実験方法が可能かどうかを検討する。
また本研究では、インポーチン beta1が神経活動依存的に核内へと輸送するタンパク質の同定を目指している。その際には、神経活動に依存したインポーチンファミリーあるいは積み荷タンパク質の翻訳後修飾が変化していることが強く示唆される。そこで、タンパク質のリン酸化について定量的な同定を試みた。マウス脳タンパク質をプロテアーゼ(トリプシン, Lys-C)で切断後、安定同位体標識をしたジメチル化を切断ペプチドに対して行う。その後、リン酸化ペプチド濃縮キット(ジーエルサイエンス)を用いてリン酸化ペプチドを濃縮しLC－MS/MSで同定した。結果、インポーチンファミリーや積み荷の候補となる転写制御に関わるタンパク質のリン酸化部位が多く含まれていた。今後は、リン酸化だけでなく、ユビキチン化やSUMO化についての定量解析法の検討も進めることを予定している。
これまでの研究では、インポーチン beta1の積み荷タンパク質の機能解析については当初の予定よりも遅れているが、積み荷タンパク質の同定や翻訳後修飾の解析については多くの成果がでているため、ほぼ順調に進んでいると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
インポーチン beta1が、神経活動依存的にシナプスから核内へと輸送する積み荷タンパク質の同定と機能解析を行うことを目的として最終年度の研究を進める。
ホルムアルデヒド処理によるタンパク質架橋と共免疫沈降法を組み合わせる実験系を用いて、コントロールマウスとてんかんを誘発したマウス脳においてインポーチン beta1との結合の度合いが異なる転写制御に関わるタンパク質を同定する。また、安定同位体標識によるジメチル化を用いた定量リン酸化プロテオーム解析を、同様にコントロールマウスとてんかんを誘発したマウス脳をサンプルとして行い、神経活動にともないリン酸化量が変化するインポーチンファミリーや転写制御に関わるタンパク質を同定する。さらに同定できたリン酸化部位に対する抗体を作成し、免疫染色法などにより、リン酸化の機能解析を行う。定量プロテオーム解析では、神経活動に依存して変化するユビキチン化やSUMO化など、リン酸化以外の翻訳後修飾についても検討する。
次に、共免疫沈降法と定量プロテオーム解析により、同定できたインポーチン beta1の積み荷タンパク質の候補分子についての機能解析を行う。具体的には、培養初代神経細胞のインポーチン beta1や神経活動に依存して翻訳後修飾が変化するインポーチンファミリー分子をsiRNAでノックダウンした際に、積み荷タンパク質の候補分子の局在が変化するかを調べる。また、培養初代神経細胞にChemical LTP処理を行った際に、積み荷タンパク質の候補分子の局在が変化するかも調べる。さらにインポーチンの積み荷となることが強く示唆されるタンパク質については、siRNAを用いて培養初代神経細胞からノックダウンし、神経細胞の生理機能に影響がでるのかを明らかにする。
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| Causes of Carryover |
使用を予定した消耗品（抗体など）が輸入のため、発注は行ったが納入が間に合わなかった。それを踏まえると、おおむね申請額を使用計画に合わせて使用した。
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Research Products
(2 results)
