2019 Fiscal Year Research-status Report
ゴルジストレス応答性Syx5と低分子化合物によるAｂeta分泌調節と神経細胞保護
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18K06468
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| Research Institution | Kyorin University |
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Principal Investigator |
須賀 圭 杏林大学, 医学部, 講師 (30306675)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山本 幸子 杏林大学, 医学部, 講師 (70434719)
丑丸 真 杏林大学, 医学部, 教授 (40265765)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 神経変性疾患 / アルツハイマー病 / Aベータペプチド / ゴルジストレス / SNARE / Syx5 / シャペロン / 低分子化合物 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ゴルジストレス応答性Syx5の発現誘導機構、およびゴルジストレスがもたらすSyx5発現変化とAベータ量比変化の機序に関して主に実験を行い知見が得られて来た。ヒトSyx5遺伝子の転写開始領域上流には、いわゆるゴルジストレス誘導性の転写因子が結合するGASE配列が存在した。これら配列を含むSyx5遺伝子の下流にルシフェラーゼを組み込んだレポーターベクターを構築し、細胞に導入してレポーターアッセイを行い、ストレス誘導剤Monensin負荷によりプロモーター活性が上昇することが確認できた。Monensin負荷に伴うCaspase3の活性化を、タイムラプスイメージングシステムを用いて解析した。ゴルジストレス負荷によるCaspase3の活性化に対するケミカルシャペロンPBAの効果を検討した。PBAはMonensinによるCaspase3の活性化を有意に抑制することができた。また作用機序の異なる誘導剤によるものも検討した。ERストレス負荷に用いるBrefeldinAと類似した機構によりゴルジストレスを誘導するGolgicideAもCaspase3の活性化を引き起こしたが、機序が異なるゴルジストレス誘導剤Exo2では活性化が見られなかった。Exo2はSyx5の転写調節による発現量上昇を起こさないことが分かったので、それらストレス応答の制御機構のシグナル伝達経路が異なることが考えられた。ゴルジストレス負荷に伴うAベータの産生量と分泌量を調べた。またAベータ４０とAベータ４２の生成比についても検討した。どのゴルジストレス負荷においても、両種のAベータの分泌抑制をきたした。したがってトータルの分泌量は減少したが、生成比を見るとAベータ４２の比が多くなったことから、ゴルジストレス誘導はアルツハイマー病態の脳において観察されるAベータ４２の比の上昇と同じような効果がある可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
神経細胞におけるゴルジストレスがもたらすAベータ量比変化の機序の検討を行った。ゴルジストレス負荷に伴うCaspase3の活性化を、タイムラプスイメージングシステムを用いて解析した。ゴルジストレス負荷によるCaspase3の活性化に対するケミカルシャペロンPBAの効果を検討したところ、PBAはMonensinによるCaspase3の活性化を有意に抑制することができた。また作用機序の異なる誘導剤によるものも検討した。ERストレス負荷時に用いていたBrefeldinAと類似した機構によりゴルジストレスを誘導するGolgicideAもCaspase3の活性化を引き起こした。一方、機序は異なるが、同じくゴルジストレス誘導剤であるExo2ではそれらが観察されなかった。Exo2はSyx5の転写調節による発現量上昇を起こさないものであるからして、それらストレス応答の制御機構のシグナル伝達経路が異なることが考えられた。ゴルジストレス負荷に伴うAベータの産生量と分泌量を調べた。またAベータ４０とAベータ４２の生成比についても検討した。どのゴルジストレス負荷においても、両種のAベータの分泌抑制をきたした。したがってトータルの分泌量は減少したが、生成比を見るとAベータ４２の比が多くなったことから、ゴルジストレス誘導はアルツハイマー病態の脳において観察されるAベータ４２の比の上昇と同じような効果があることが分かった。分泌されず神経細胞内に蓄積した量を調べることにより生成量を解析する予定である。また次年度の準備のため、CRISPR/Cas9法を用いたノックアウト細胞の確立も開始した。
研究分担者一名が年度途中から産前・産後休暇を取得したことと、新型コロナウイルス感染拡大による自粛要請に伴い共同研究施設が閉鎖されている影響により、一部の実験と解析が進められず計画にやや遅れが出る結果となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、Syx5と低分子化合物によるAベータ量比調節効果の検討から行う。そのためにSyx5過剰発現、shRNAによる抑制、CRISPR/Cas9法を用いたノックアウト細胞、候補である低分子化合物を添加した細胞で、低分子化合物が、ゴルジストレスによって起こるAベータ比の変化を軽減させることができるかを検討する。準備としてCRISPR/Cas9法を用いたSyx5ノックアウト細胞の確立のためのベクター作製と発現チェックを行った。発現効率と発現量の検討を迅速かつ生細胞で行うために、共同研究施設に備わっている蛍光顕微鏡を用いた。それにより発現効率を上げる条件を見出せたので、発現マーカーを指標にした陽性細胞の選別を行う計画を立てた。共同研究施設に備わっているFACSとセルソーターを用いたノックアウト細胞の選別を開始する段階にある。本来であれば生細胞を蛍光顕微鏡下で観察するだけで発現効率とトランスフェクション効率を迅速かつ簡便に解析だが、施設の閉鎖のため、その対応策として、細胞を一部サンプリングしてタンパク調製を行い、WB法を用いて蛍光タンパクを検出する方法を確立した。感度が低い系ではあるが、施設閉鎖が解かれるまでの代替の方法とする。またゴルジストレスによる神経細胞死に対する保護効果の検討を次いで行う。上述した細胞でのタイムラプスイメージングや生存率測定により、細胞死が出現する時間経過を比較して、Syx5発現量や低分子化合物に保護効果があるかを調べる。総括としてゴルジストレスから細胞死に至る過程のイメージングによる保護の時空間的な解析を行う。これによりゴルジストレスから神経細胞死に至る過程をモニターしながら同時にAベータ産生の動態をとらえ、ゴルジストレスがどのように細胞全体に波及し、いつどこでAベータが産生するかを可視化し、Syx5と低分子化合物の保護作用を総括できると考えている。
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| Causes of Carryover |
課題申請時に国内学会参加のために申請していた旅費や外部委託解析費の支払いを他の研究費より支出したため、当初想定した金額より支出額が減った。また新型コロナウイルス感染拡大による自粛要請に伴い共同研究施設が閉鎖された影響により、一部の実験と解析が進められず、閉鎖解除が見込める次年度使用額として計上するため。
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