2018 Fiscal Year Research-status Report
マウス一次視覚野における可塑的変化の多様性を生み出す遺伝子群の同定
| Project/Area Number |
18K06476
|
|---|
| Research Institution | National Institute for Physiological Sciences |
|---|
Principal Investigator |
林 健二 生理学研究所, 基盤神経科学研究領域, 助教 (50512349)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | 眼優位可塑性 / in vivo カルシウムイメージング / 遺伝子発現解析 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
一次視覚野では外界からの入力に伴い、眼優位可塑性が起こることが知られる。通常、マウス一次視覚野の両眼視領域では両眼からの視覚入力に対する応答が特定のバランスで均衡するが、臨界期に片眼遮蔽すると大部分の細胞は開眼側の視覚入力に対して反応するように選択性が大きくシフトする。現在までの研究により可塑性の分子メカニズムの詳細は分かりつつあるものの、従来の解析ではあくまで細胞の平均的な挙動を解析の対象としていた。可塑的な変化の強度の違いがその後の細胞ごとの多様な運命を決定する可能性があるが、そのような観点からの研究は進んでいない。In vivo カルシウムイメージングと一細胞由来のmRNAの遺伝子発現の解析を行うことで、そのメカニズムを明らかにすることを目的とする。
平成３０年度は、本研究課題を遂行するための技術の開発を中心として行った。従来の一般的なシングルセルRNAseq解析ではトリプシン処理を行うことで組織を単一細胞に分離している。しかしながら、この処理を行うと細胞の空間的な情報が失われるために、遺伝子の発現プロファイルとイメージングで得られた細胞の生理学的な特性とをマッチングさせることができない。この問題点を克服するために、我々はカルシウムイメージング後にin vivoで一細胞の採取することに挑戦し、一細胞を採取することに成功した。
まず、簡単な実験系で細胞の生理学的な特性と遺伝子発現との関係を対応付けるために、特定の空間周波数に特異的に応答する神経細胞に着目して実験を行うことから始めた。遺伝子の発現変動を極力抑えるためにOGB1を用いたin vivoカルシウムイメージングから周波数特異性のマップを作成し、マップを手がかりに任意の細胞をガラスピペットを用いた手法により採取することに成功した。一細胞由来のcDNAをバイオアナライザーで解析したところ、RNAseq解析を行うのに十分な量を得られることが確認できた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
平成３０年度はin vivoカルシウムイメージング後にガラスピペットを用いた細胞の採取を行う技術の開発を中心に行ってきた。In vivo カルシウムイメージングと細胞の採取という一連の実験フローを効率的に開発するために、まずは特定の空間周波数に特異的に応答する神経細胞に着目して実験を行うことにした。カルシウムイメージングは順調に進めることができたものの、細胞の採取は二光子顕微鏡下のin vivoマウスで行う必要性のために技術的に容易ではなく、セットアップの最適化や技術習得のための時間が必要であった。
得られたmRNAはSMART-Seq Ultra Low Input RNA Kitで増幅し、バイオアナライザーにてRNAseqに十分な量のcDNAが得られていることを確認している。RNAseqは発注しているものの、まだ結果が得られていないため解析は進んでいない。今後、得られたRNAseqの解析結果から細胞採取にどの程度、別の細胞由来のmRNAのコンタミネーションがあったのかを見極める必要がある。
眼優位可塑性を評価するためのインジケーターはすでに準備ができており、AAVでの発現確認も済ませている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
まずはRNAseqの結果からin vivoでの細胞採取の実験系がうまく働くのを確証することを目標にして実験を進める。In vivoでの細胞採取の実験系が確立できると、カルシウムイメージングで得られる生理学的特性と遺伝子発現プロファイルを一細胞レベルで対応付けられることができるようになり、応用範囲の広い強力なツールとなる。しかしながら、この一連の実験系を用いている先行研究は見られないため、自分で開発を進めてゆく必要がある。先述のとおり、RNAseqを行う十分な量のcDNAを得ることはできたものの、ガラスピペットを用いた細胞分取を行っているため、得られた細胞にどの程度のコンタミネーションが見られるのかを評価する必要がある。具体的には、サンプル内にどの程度、GFAPなどのグリア細胞のマーカー遺伝子や、神経細胞のサブタイプ特異的なマーカー遺伝子が混入しているかを解析したい。
実験系の確証を終えたら、本題の眼優位可塑性の程度を評価した細胞で、どのような遺伝子発現プロファイルが見られるのかを解析する。現在のところは、眼優位可塑性の強度の評価は開発を行った最初期遺伝子ベースのAAVのインジケーターを用いることを想定している。
|
| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じたのは、AAVのツール開発が円滑に進んだため当初予定していたよりも試薬や消耗品が少なかったことと、さらに、RNAseqを実施できた回数が想定よりも少なかったことに起因する。この差額分は来年度以降のRNAseqおよび、解析を行うためのソフトウェアを購入するための費用に用いたいと考えている。
|
Research Products
(1 results)
