Identification of neural pathway involving innate fear-induced hypothermia and bradycardia

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K06515
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 櫻井 勝康 筑波大学, 国際統合睡眠医科学研究機構, 助教 (70507920)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 体温 / 神経回路

Outline of Annual Research Achievements

生物は恐怖刺激に対して生存戦略の中で最も適切な行動・生理的反応を無意識に選択・実行する。様々な恐怖刺激に適切に対応して生存確率を高めるためには非常に素早い反応が求められることから、脳内には心拍数、体温を急激に変化させる緊急用スイッチが存在すると考えられる。現在のところ、恐怖刺激に対して心拍数、体温を急激に調節する緊急用スイッチとして機能する脳領域および神経細胞群は同定されていない。本研究では、恐怖刺激に対する生理反応の中で急激な体温および心拍数の低下を制御する緊急用スイッチとして機能する脳領域および神経細胞群を同定することを目的として以下の実験を行った。
1.恐怖刺激による体温低下に関与する神経細胞群の同定
恐怖刺激（恐怖臭）をマウスに与えた後、 脳のサンプリングを行う。活性化した神経細胞のマーカーであるFosの発現を免疫組織化学染色によって可視化する。すべての脳切片の染色像を共焦点レーザー顕微鏡で取得する。この実験を、野生型マウスおよび刺激臭に対して恐怖反応を示さないマウス（Trpa1-KO）を用いて行い、両者のFos発現パターンを比較した。その結果、野生型マウスとTrpa1-KOマウスの間で神経活動の異なる脳領域を同定することができた。これらの脳領域は、恐怖刺激による体温低下の誘発に関与している可能性が考えられた。
2.オプトジェネティクスによる恐怖刺激情報を処理する脳領域の活性化と急激な体温・心拍数低下との因果関係の検討
同定した脳領域の神経細胞群の活動が体温低下を誘発するのかを検討するために、オプトジェネティクスを用いて神経活動の操作を行った。上記で同定した神経細胞群をChR2で標識し、光ファイバーを介して光刺激を行い、体温変化を検討した。その結果、Fosのマッピングによって同定された脳領域の中で、光刺激によって体温低下を引き起こすことができる脳領域の同定に成功した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

存的に標識・操作することができるCANEシステムをもちいて標識・操作する予定であった。しかし、CANEシステムに必要なトランスジェニックマウスの導入及びそのコロニーの増加に時間がかかったために、方法を変更した。変更後の実験内容および進歩状況は以下の通りである。
１．恐怖刺激による体温低下に関与する神経細胞群の同定
恐怖刺激（恐怖臭）をマウスに与えた後、 脳のサンプリングを行う。活性化した神経細胞のマーカーであるFosの発現を免疫組織化学染色によって可視化する。すべての脳切片の染色像を共焦点レーザー顕微鏡で取得する。この実験を、野生型マウスおよび刺激臭に対して恐怖反応を示さないマウス（Trpa1-KO）を用いて行い、両者のFos発現パターンを比較した。その結果、野生型マウスとTrpa1-KOマウスの間で神経活動の異なる脳領域を同定することができた。これらの脳領域は、恐怖刺激による体温低下の誘発に関与している可能性が考えられた。
２．オプトジェネティクスによる恐怖刺激情報を処理する脳領域の活性化と急激な体温・心拍数低下との因果関係の検討
同定した脳領域の神経細胞群の活動が体温低下を誘発するのかを検討するために、オプトジェネティクスを用いて神経活動の操作を行った。上記で同定した神経細胞群をChR2で標識し、光ファイバーを介して光刺激を行い、体温変化を検討した。その結果、Fosのマッピングによって同定された脳領域の中で、光刺激によって体温低下を引き起こすことができる脳領域の同定に成功した。

Strategy for Future Research Activity

１．DREADDシステムによる恐怖刺激情報を処理する脳領域の活性化と急激な体温・心拍数低下との因果関係の検討
昨年度のFosマッピングおよびオプトジェネティクスによる実験により、恐怖刺激によって体温低下を誘発する神経細胞群の同定に成功した。これらの神経細胞群の神経活動を抑制することによって恐怖刺激による体温低下の誘発を抑制することができるのかを検討するために、以下の実験を行う。GiカップリングGPCRを発現することができるアデノ随伴ウイルス（AAV-hM4Di）を昨年度に同定した恐怖刺激による体温低下誘発に関与する神経細胞群に感染させる。hM4Diの発現を十分に待ったのち、マウスの腹腔にCNO（Clozapine-N-oxide)を注入し、標識神経細胞群の神経活動を抑制する。このDREADDシステムによる神経活動抑制下のマウスに恐怖刺激臭を曝露し、その時の体温および心拍数をテレメトリー法により計測する。恐怖刺激による急激な体温および心拍数の低下を制御する緊急スイッチが抑制された場合、これらの生理的変化は認められないと予測される。
２．恐怖刺激によって急激な体温・心拍数の低下を引き起こす脳領域の神経活動の計測
恐怖刺激によって体温・心拍数の低下を誘発する神経細胞群の神経活動を計測するために以下の実験を行う。
カルシウムセンサーであるGCaMP6を発現するアデノ随伴ウイルスを昨年度に同定した恐怖刺激による低体温誘発に関与する神経細胞群に感染させる。つぎに、その標的領域の上部に光ファイバーを挿入・固定する。これにより、恐怖刺激によって活性化する、すなわち急激な体温もしくは心拍数の低下に関わる神経細胞群の神経活動を計測することが可能となる。恐怖刺激によって神経活動が活性化した後に体温低下もしくは心拍数の低下が観察されることが推察される。また、体温・心拍数の上昇時にはこれらの神経細胞の神経活動は低下することが推察される。

Causes of Carryover

本年度は主に消耗品に使用し、物品購入には使用しなかった。本年度の実験で得ることのできたデータをもとに、必要な設備品を購入する予定である。