2019 Fiscal Year Research-status Report
チロシンを特異的に検出可能な化学発光分析法の開発と創薬・診断技術への展開
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18K06599
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
岸川 直哉 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(薬学系), 准教授 (90336181)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | チロシン / 化学発光 / アルカリホスファターゼ / 酵素活性測定 / リン酸化チロシン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質は生命維持に関わる重要な生体分子であり、その効果的な定量・解析法は様々な分野で必要とされている。タンパク質を構成するアミノ酸の中でもチロシンは、様々な酵素の標的となるアミノ酸残基であり、チロシンリン酸化の異常が発がんに関与することやチロシン代謝異常が種々の疾患の原因となることが知られている。このようなことから、チロシンに特化した分析法は、疾患の発症機構の解明や早期診断法の開発に有用であると考えられる。我々はこれまでに、化学発光試薬であるルミノール誘導体とチロシンとの混合溶液に紫外線照射を行うという単純な操作で、チロシン濃度に応じて増大する発光が観察されることを見出した。本年度は、この現象に基づいて、リン酸化チロシンをチロシンへと脱リン酸化する酵素であるアルカリホスファターゼの活性を化学発光により測定する手法の開発を行った。本法において、チロシンは強い発光を与える一方でリン酸化チロシンは極めて弱い発光しか与えない。従って、アルカリホスファターゼによるリン酸化チロシンからチロシンへの変換に伴う発光強度の増強に基づいてアルカリホスファターゼ活性の測定が可能である。最適反応条件を確立後、アルカリホスファターゼ活性の検量線を作成したところ、15-3000 U/L の濃度範囲において活性と化学発光強度の間に相関係数 r=0.996 の良好な直線関係が得られ、15 U/Lの検出下限 (blank + 3SD) が得られた。本法はアルカリホスファターゼ活性測定法として広く用いられている p-ニトロフェニルリン酸を基質とする比色法よりも高感度であった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
チロシンとルミノールの混液に紫外線を照射することで強い発光が生じるという現象を、チロシン変換酵素の活性測定に応用することに成功した。本法において、チロシンは強い発光を示す一方で、わずかに構造の異なるリン酸化チロシンは極めて弱い発光しか与えないことを見出した。そこで、リン酸化チロシンからチロシンへの変換に伴う発光強度の増強を利用することで、予想通りにアルカリホスファターゼ活性を化学発光測定することができた。本法は、特殊な酵素基質を用いることなく極めて簡便な測定操作でアルカリホスファターゼ活性を効率よく測定可能であった。
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| Strategy for Future Research Activity |
チロシンとルミノールの混液に紫外線を照射することで強い発光が生じるという現象を、既にチロシンの化学発光マイクロプレートアッセイへと開発することに成功している。そこで次に、この化学発光反応を組み込んだ HPLC システムの構築を試みる。すなわち、試料中の各成分を HPLC カラムで分離後にオンラインで紫外線照射を行い、照射後の溶液をルミノールと混合して生じる発光を検出するシステムである。これにより、オキシトシンといったチロシンペプチドの HPLC 化学発光検出法の開発を試みる。また、フェニルアラニンヒドロキシラーゼといったアルカリホスファターゼ以外のチロシン変換酵素の活性測定法の開発を引き続き進めていく。
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| Causes of Carryover |
本年度における検討では、研究室に現有の装置と試薬を用いて実施可能であったため。
使用計画としては、HPLC システムを構築するための機器の購入や新規酵素活性測定法開発に必要な試薬の購入に充てる予定である。
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