2018 Fiscal Year Research-status Report
Synthesis of polymer-enzyme conjugates for site-specific modification of therapeutic proteins
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18K06602
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| Research Institution | Gifu Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
笹井 泰志 岐阜薬科大学, 薬学部, 准教授 (60336633)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | バイオコンジュゲーション / 高分子－酵素複合体 / 温度応答性高分子 / 原子移動ラジカル重合 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、タンパク質医薬品の体内動態改善に有効なタンパク質のポリエチレングリコール（PEG）修飾について、位置特異的かつ効率的な反応を触媒する再利用可能な温度応答性高分子－酵素（transglutaminase）コンジュゲートの合成について検討を進めている。本コンジュゲートは、調製や反応系からの回収の際は酵素活性に影響が小さい低温環境の不均一系で実施し、使用の際は酵素活性に有利な酵素の至適温度で均一溶液状態とすることを目指しいている。
本年度は、温度応答性高分子の設計とその物性評価を中心に検討した。これまでの研究成果で修飾により酵素の熱安定性改善が期待できるvinylmethylether-maleic acid copolymer（VEMAC）の主鎖上カルボキシル基から、上限臨界溶液温度（UCST）を有するpoly(sulfobetaine methacrylate)（PSBMA）側鎖を伸長させた櫛型高分子を設計し、合成した。本櫛型高分子のUCSTは、PSBMA側鎖の導入密度と精密ラジカル重合法（原子移動ラジカル重合法（ATRP）による鎖長の制御を行うことで、目標通りの酵素の至適温度より低温の20℃～40℃の範囲でUCSTを持たせ、その制御が可能であった。また、特定のPSBMA側鎖の導入密度および鎖長を有する櫛型高分子は、水中にてUCST以下でVEMACを外層とする直径200nm程度の高分子ミセル様の粒子を形成することが示唆された。4℃条件下、ミセル様粒子表面のVEMACのカルボキシル基とモデル酵素として利用したトリプシンのコンジュゲートでは、UCST以上の均一な溶液状態としたときも熱安定性が大きく改善され、酵素活性も維持されることを明らかにした
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
予定通り、酵素修飾用の20℃～のUCSTを有する温度応答性櫛型高分子を合成し、その物性を明らかにすることができた。タンパク質のPEG修飾を触媒するTransglutaminase from Streptomyces mobaraensis（mTGase）の入手および精製に時間を要し、合成した櫛型高分子とmTGaseとのコンジュゲート合成には至らなかったが、昨年度のモデル酵素トリプシンを用いたコンジュゲート合成条件を参考に検討を進めていく予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
温度応答性櫛型高分子は、そのPSBMA導入密度およびグラフト鎖長により、UCST未満で異なる粒子径の粒子に自己組織化する。このとき、粒子径により粒子表面のVEMACの濃度や溶解状態が異なることが予想され、その結果、mTGaseとの反応性にも影響することが考えられる。今後は、活性を保持した状態でのmTGase修飾に適した温度応答性櫛型高分子のスクリーニングと修飾条件の最適化を行う。benzyloxycarbonyl-L-glutaminylglycine（Z-Gln-Gly）を基質として酵素活性の速度論的解析等からタンパク質医薬品のPEG化に適当なコンジュゲートを見出す。さらに、熱安定性、温度刺激による反応系からの回収効率、再利用性など観点から、コンジュゲート合成条件（縮合試薬の種類、反応条件等）の最適化を図る。さらに、モデルタンパク質医薬品を用い、位置特異的PEG鎖導入や副反応抑制を指標とし、他の報告との優位性についても検証する。PEG化の反応速度、収率にも着目し、高効率的で位置選択的なPEG化が可能なコンジュゲートに最適化する。
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