2018 Fiscal Year Research-status Report
B型肝炎ウイルスの肝細胞侵入および増殖機構の構造生物学的解析
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18K06606
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
横川 真梨子 慶應義塾大学, 薬学部(芝共立), 講師 (60648020)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大澤 匡範 慶應義塾大学, 薬学部(芝共立), 教授 (60361606)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | B型肝炎ウイルス / NTCP / タンパク質－タンパク質相互作用 / ナノディスク / NMR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
B型肝炎ウイルス（HBV）がどのようにして肝細胞特異的に侵入するのか、およびHBVが宿主の肝細胞内で増殖する機構を構造生物学的に明らかとすることで、新たな作用点を持つ抗HBV薬を創製することを目指している。
本年度は、HBVの受容体であるNTCPの調製法確立を目指した。まず、大腸菌発現系を用いて、可溶性タンパク質との融合タンパク質としての発現・精製を試みたが、精製過程における分解が問題となった。そこで、プロテアーゼの混入の可能性が低い無細胞タンパク質合成系に変更した。小スケールでの発現を試みたところ、目的タンパク質を不溶性画分に、SDS-PAGE上でCBB染色によりほぼ単一バンドとして検出することに成功した。さらに、界面活性剤により目的タンパク質を可溶化できることも確認し、プレリミナリーな結果であるが、preS1と結合することをプルダウン実験により検出した。立体構造解析に向けて無細胞タンパク質合成系における反応条件や可溶化条件の最適化を行うことで、NTCPを大量に調製できることが期待される。
また、HBcが会合したキャプシドの調製を行った。キャプシドが形成されたことは、負染色電子顕微鏡観測により確認した。等温滴定型カロリメトリーと溶液NMR法により、キャプシドとpreS1、preS2、preSの相互作用解析を行った。その結果、LHBsはpreSのうちpreS2領域を中心にキャプシドと結合することが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
PreSとNTCPの相互作用による肝細胞侵入機構の解明については、NTCPを無細胞タンパク質合成系で発現させることに成功し、立体構造解析に適したサンプルを調製する目途がたった。キャプシドとLHBsの相互作用による宿主の肝細胞内におけるウイルス再構築機構の解明については、キャプシドを調製してpreSとの相互作用を検出しており、研究は順調である。
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| Strategy for Future Research Activity |
無細胞タンパク質合成系を用いて調製したNTCPのNa+・胆汁酸共輸送活性およびpreS1結合活性を確認し、preS1との相互作用解析を行う。また、立体構造解析に向けて、収量を増大させるための条件検討を行う。LHBs全長の発現・精製法を確立し、NTCPとの相互作用解析を行う。
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| Causes of Carryover |
＜理由＞
無細胞タンパク質合成系の導入により、精製操作を減らすことができ、必要な試薬量も減ったため。
＜使用計画＞
研究計画の遂行には、今後、無細胞合成反応のスケールアップが必要である。条件検討を行ったうえで、必要な反応スケールでの無細胞タンパク質合成を行うため、キットを大量に購入する必要があり、これらの購入に充てる予定である。
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