2022 Fiscal Year Annual Research Report
Effects of multiple binding sites of CYP2C9 on its allosteric modulation
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18K06613
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| Research Institution | Doshisha Women's College of Liberal Arts |
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Principal Investigator |
前川 京子 同志社女子大学, 薬学部, 教授 (70270626)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
安達 基泰 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 量子生命科学領域, 上席研究員(定常) (60293958)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | チトクロームP450 / 遺伝子多型 / 構造活性相関 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は、CYP2C9とP450 Reductase（CPR）の相互作用様式を明らかにする目的で、ヒトCPRの大腸菌での発現系、精製系の構築を継続した。発現に用いる大腸菌の種類や培養条件を最適化し、大量発現を可能とした。NiアフィニティークロマトグラフィーによりCPRを一次精製した後、疎水性相互作用クロマトグラフィーで二次精製し、精製度が高いCPRを得た。CPRの活性をCytochrome C 還元活性を指標に評価し、高い比活性を有することを確認した。一方で、精製CPRを電子伝達のための酵素として用いてCYP2C9の代謝活性を測定すると、膜画分CPRを酵素として用いた場合と比較して低く、脂質膜による再構成の必要性が示された。
研究機関全体を通して、代謝活性測定、Ｘ線結晶構造解析、及び等温滴定カロリメトリー(ITC)法を用いて、CYP2C9遺伝子多型による活性減弱メカニズムを解析した。CYP2C9.2変異体のX線結晶構造解析の結果から、野生型とCYP2C9.2ではF-Gヘリックス間に最も大きな構造上の違いを認めた。また、CYP2C9.2では活性中心のロサルタンは、そのビフェニル環とF476残基との間で形成されたππ結合によりアクセスチャネル側に結合していた。この結果、アクセスチャネルへの２分子目のロサルタンの結合が妨げられている可能性があり、*2がロサルタンに対して活性低下アレルであることと関連している可能性が示唆された。ITC法を用いた相互作用解析から、CYP2C9.1とロサルタンとの相互作用はエンタルピー依存的な発熱反応であった。さらに、CYP2C9.1とCYP2C9.2のロサルタンに対するKd値はほぼ同等であり、結合部位数Nは両者で変化しないことが明らかになった。今後はCPR共存下でCYP2C9のアロステリック性に対する遺伝子変異の影響に関して検討を行う予定である。
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