2018 Fiscal Year Research-status Report
合理的デザインによる芳香族有機酸反応性酵素の創成と有機溶剤健康診断への応用
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18K06616
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| Research Institution | Setsunan University |
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Principal Investigator |
西矢 芳昭 摂南大学, 理工学部, 教授 (70612307)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 芳香族有機酸 / 有機溶剤取扱作業 / 生体成分分析 / 酵素的測定法 / 自動分析 / タンパク質工学 / ドッキングスタディ / 変異体酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、計算科学的技術を利用することで酵素反応を微視的に解析し、立体構造に基づく活性中心の合理的デザインにより、芳香族有機酸の迅速・簡便な酵素的測定法に必要な新規反応性酵素を創成することを最終目的とする。平成30年度は、当初計画した既知酵素構造の合理的デザインに基づく新規基質に対する変異酵素の設計に加え、変異酵素の作製と基質特異性および反応性の評価を行った。
１．既知酵素構造の合理的デザインに基づく新規基質に対する変異酵素の設計
既知酵素として乳酸菌の乳酸オキシダーゼを選択し、ドッキングスタディおよび反応シミュレーションにより、本来の基質である乳酸に替えてマンデル酸を用いた場合の活性中心アミノ酸残基を種々変化させ、計算機モデル上で高選択性と反応性を具備した新たな変異酵素を設計した。また、既知酵素として超好熱菌のカルボキシペプチダーゼを選択し、高次構造および活性中心予測により、本来反応性が認められないオルトメチル馬尿酸に対する反応性を具備した新たな変異酵素を設計した。芳香族有機酸のマンデル酸およびメチル馬尿酸は、有機溶剤検診の測定対象化合物であり、スチレンおよびキシレンに暴露された有機溶剤取扱作業者の尿中最終代謝産物となる。
２．変異酵素の作製と基質特異性および反応性の評価
設計した乳酸オキシダーゼの変異酵素を実際に作成し、特性を評価した。乳酸オキシダーゼはマンデル酸に対するキネティックパラメーターが算出限界以下だったが、変異体のマンデル酸に対するKm値は0.17mMと見積もられ、乳酸オキシダーゼの乳酸に対するKm値より低値となった。逆に変異体の乳酸に対するキネティックパラメーターが算出限界以下となった。以上より、活性部位周辺のポケットを広げ嵩高い基質との立体障害を軽減することで、マンデル酸の乳酸に対する活性比率が大幅に増加し、マンデル酸オキシダーゼと呼べる変異酵素を創成できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
平成30年度は、既知酵素構造の合理的デザインに基づく新規基質に対する変異酵素の設計に注力し、マンデル酸およびメチル馬尿酸反応性酵素をベース酵素の予測構造より合理的にデザインすることができた。また、有機溶剤検診の測定対象化合物である3種の芳香族有機酸に対する簡便な酵素的測定法を考案し、主反応酵素を除く追随酵素反応の課題を解決できた。本成果について、研究協力企業と特許を共同出願した。
さらに、変異酵素の作製と基質特異性および反応性の評価にも着手し、乳酸オキシダーゼを基にタンパク質工学的手法によりマンデル酸オキシダーゼと呼べる基質特異性、反応性を有する変異酵素を創成することに成功した。メチル馬尿酸反応性酵素についても、現在、変異酵素の作製と反応性の評価に着手している。
これら芳香族有機酸は、有機溶剤に暴露された作業者の尿中に排出される最終代謝産物である。本研究では、有機溶剤取扱作業者の健康被害防止のため、迅速・簡便な芳香族有機酸の酵素的測定法の確立を目指している。従来と異なり、まず理想的な酵素的測定法を考案した。次いで、既知酵素高次構造の合理的デザインに着目し、測定法に必要な新規芳香族有機酸反応性酵素を創成するという流れで検討を進めている。
以上より、現時点では当初に平成30年度の研究実施計画として掲げていた内容を超える検討を進めており、多少の方策修正はあったものの、期待した以上の進展が見られている。
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| Strategy for Future Research Activity |
変異酵素の作製と基質特異性および反応性の評価を、引続き実施する。
合理的デザインにより設計した各種変異酵素を実際に作成し、それらの特性評価によりデザイン方法の検証を行う。変異酵素評価結果のフィードバックに基づく変異デザインのブラッシュアップにより、芳香族有機酸反応性酵素の創成を行う。
既に平成30年度に創成の目処を得たマンデル酸オキシダーゼに続き、馬尿酸加水分解酵素活性、メチル馬尿酸加水分解酵素活性を有する変異体酵素の創成にできるだけ早い段階で目処をつけたい。
さらに、令和2年に実施予定であった変異体酵素の検査への応用についても、前倒しで可能性を検討できればと考えている。このように酵素反応を利用して芳香族有機酸を測定する方法は、今回初めて提案するものであるが、過去の臨床検査薬開発の実績から実現可能性は十分有ると期待している。
以上の研究によって、酵素反応の理解と機能改変一般則の解明にも大きく貢献できると考える。
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| Causes of Carryover |
計画当初は、芳香族有機酸の簡便な酵素的測定法に対する追随酵素反応の課題解決に相当の費用を有すると想定していたが、比較的短期に課題を解決できた。一方、更なる芳香族有機酸反応性酵素の創成には、次年度以降に行う変異酵素評価結果のフィードバックに基づく変異デザインのブラッシュアップが重要となり、評価用試薬等に使用額を追加したい。
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