2019 Fiscal Year Research-status Report
癌抑制キナーゼSTK11によるデスレセプターシグナルのバランス制御機構の全容解明
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18K06622
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
野口 拓也 東北大学, 薬学研究科, 准教授 (20431893)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | アポトーシス / キナーゼ / シグナル伝達 / Fasリガンド / カスパーゼ / STK11 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は「FasシグナルにおけるSTK11のキナーゼ活性非依存的なアポトーシス促進機構の解析」を下記の通り実施した。
① STK11による外部経路伝達促進機構の解析; Fasリガンド処置時、STK11依存的に形成されるCaspase-8とCaspase-3を含む高分子複合体について、これまで界面活性剤不溶性画分をウェスタンブロットすることにより解析していた。今年度は、免疫染色法およびショ糖密度勾配遠心法により複合体形成を評価することで、aspase-8とCaspase-3を含む高分子複合体がSTK11依存的に形成されていることが再確認できたとともに、細胞内局在や高分子複合体の大きさについても考察することができた。
② STK11による外部経路伝達促進の証明; STK11によるFas誘導性アポトーシス促進が、内部経路に依存せず外部経路に依存したものであるかを、内部経路が活性化されない内部経路不全細胞を用いて評価した。その結果、STK11は内部経路に依存せず、Fas誘導性アポトーシスを促進することが示された。
③ STK11によるミトコンドリア外膜透過を介したアポトーシス促進機構の解析; 内部経路不全細胞においてSTK11を安定発現した場合、Fasリガンド処置依存的なミトコンドリア膜電位の低下が認められることが判明した。この結果から、STK11は外部経路の伝達を促進するだけではなく、非典型的にミトコンドリア外膜透過を行うことによっても、Fas誘導性アポトーシスを促進することが示唆された。次に、ミトコンドリア外膜透過により、ミトコンドリアから細胞質に遊離する各種細胞死促進因子ついて、Fas誘導性アポトーシス誘導への関与をノックダウンによる実験で検証した。その結果、STK11発現細胞において、Fas誘導性アポトーシスがAIF依存的に促進されることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は、昨年度に引き続き、STK11によるキナーゼ活性非依存的なFas誘導性アポトーシス促進経路の解析を行った。まず、STK11発現細胞においてFasリガンド処置依存的に形成されるCaspase-8とCaspase-3を含む高分子複合体を、ショ糖密度勾配遠心法および免疫染色法によって評価する実験系を構築し、高分子複合体の存在を明らかにした。しかし、複合体の分子実態は依然不明であるため、来年度も引き続き解析を進める。次に、アポトーシス関連因子群のノックアウトおよびノックイン細胞を新たに樹立し、Fas誘導性アポトーシスを促進する際にSTK11が活性化するシグナル経路を同定した。また、その詳細についても解析を進め、STK11は非典型的な機構でミトコンドリア外膜透過を誘導し、アポトーシスシグナルを増幅していることを発見した。さらに、STK11依存的なミトコンドリア外膜透過に伴ってミトコンドリアから細胞質に放出される因子に着目して解析を行った結果、STK11によるFas誘導性アポトーシスの促進にアポトーシス促進因子AIFが関与することが判明した。
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| Strategy for Future Research Activity |
Fas誘導性アポトーシスは、ミトコンドリアを介する内部経路とミトコンドリアを介さない外部経路という、二つの経路によって誘導される。特に、外部経路は、より効率的にアポトーシスを誘導できる経路であるとされるが、癌細胞では外部経路の活性化が起こりにくくなっていることが示され、癌細胞におけるアポトーシス耐性の一因であると考えられている。昨年度の解析により、外部経路の活性化には、STK11依存的な高分子複合体形成によるCaspase-8とCaspase-3の近接化が必要であることが明らかになった。加えて、STK11は非典型的な機構を介したミトコンドリア外膜透過の亢進によってアポトーシスシグナルを増幅することが判明した。そこで、本年度においては、下記3つの課題を遂行し、「STK11によるFas誘導性アポトーシス促進機構の全容解明」を目指す。
1. 昨年度の研究において、非典型的な機構を介したミトコンドリア外膜透過の亢進により細胞質に放出されるアポトーシス促進因子の一つであるAIFが、STK11によるアポトーシス促進作用に寄与することが新たに判明した。そこで、AIFに着目した解析を行い、Fas誘導性アポトーシスにおけるAIFの役割を解明する。
2. 高分子複合体形成による外部経路活性化機構とAIF依存的なアポトーシス促進機構との関連を明らかにするために、AIF欠損によるCaspase活性化への影響や、Caspase阻害によるAIF局在変化への影響などを生化学的手法により解析し、AIFを介したSTK11によるFas誘導性アポトーシス促進機構の全容を解明する。
３. ゼノグラフトモデル（STK11を再構築したHeLa細胞を免疫不全マウスに移植）を用いた解析を行い、癌組織のアポトーシス耐性獲得における STK11の病理的役割を解析する。
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