2018 Fiscal Year Research-status Report
Identification of endoplasmic reticulum molecular chaperones to determine antigen presentation to cytotoxic T lymphocytes
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18K06631
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| Research Institution | Saitama Medical University |
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Principal Investigator |
松井 政則 埼玉医科大学, 医学部, 准教授 (50199741)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 細胞傷害性T細胞 / HLAクラスI / 抗原提示 / 分子シャペロン / 小胞体 / アジュバント / TAPBPR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
がん細胞を攻撃する細胞傷害性T細胞(CTL)を研究する上で、HLAクラスI (HLA-I)分子による抗原提示機構を理解する事は重要である。私は、わずか１個のアミノ酸置換のあるHLA-A2の変異分子HLA-A2-H74Lが、小胞体内で自己ペプチドと結合するにもかかわらず抗原ペプチドとは結合できないためCTLへ抗原提示できないことを発見した。この現象から、小胞体内のHLA-I・ペプチド複合体形成過程で、自己ペプチドから抗原ペプチドへと置き換える新たな分子シャペロンの存在が強く示唆される。本研究の目的は、この未知の分子シャペロンを同定することである。
実験計画に沿って、FLAGタグ融合HLA-A2またはHLA-A2-H74Lを発現させた細胞株の細胞溶解液を調整し、抗FLAG抗体で免疫沈降を行った。SDS-PAGEの分離パターンを比較したところ、HLA-A2のみに見られるバンドが見られた。そこで質量分析にかけてタンパク質を同定したが、分子シャペロンではなかった。
最近、低親和性ペプチドから高親和性ペプチドへと置き換える新しい分子シャペロン、TAPBPR (Science 358:1060 & 1064, 2017) が発見された。特性が類似しているため我々の求めている分子シャペロンではないかと考えたが、異なることがわかった。しかし、なんらかの関係があると考え、GFP融合TAPBPRを発現させた細胞を作製し、抗GFP抗体で免疫沈降を行った。その分離パターンを比較したところ、明らかにHLA-A2発現細胞にのみ見られるバンドが存在した。今後、このバンドに相当するタンパク質を同定する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の実験計画に沿って、FLAGタグ融合HLA-A2またはHLA-A2-H74Lを発現させた細胞株の細胞溶解液を調整し、抗FLAG抗体で免疫沈降して、SDS-PAGEの分離パターンを比較した。HLA-A2のみに見られるバンドが見られたため、質量分析にかけてタンパク質を同定したが、分子シャペロンではなくHLA-A2分子自身であることがわかり、有益な結果は得られなかった。その後、低親和性ペプチドから高親和性ペプチドへと置き換える新しい分子シャペロン、TAPBPR (Science 358:1060 & 1064, 2017) が発見された。TAPBPRの特性が類似しているため、我々の求めている分子シャペロンはTAPBPRと相互作用していると考えた。そこで、発現ベクターにGFP融合TAPBPR遺伝子を組み込み、HLA-A2またはHLA-A2-H74L発現細胞に遺伝子導入し、GFP融合TAPBPRを発現する細胞株を作製した。そして、抗GFP抗体で免疫沈降を行い、その分離パターンを比較したところ、明らかにHLA-A2発現細胞にのみ見られるバンドが存在した。すなわち、TAPBPR-HLA-A2-ペプチド複合体に新たなタンパク分子が結合しており、HLA-A2-H74Lでは1つのアミノ酸変異(H74L)のためにその分子が結合できないと予想できる。この分子は、我々が求めている分子シャペロンである可能性があるため、このバンドに相当するタンパク質を質量分析で同定する予定である。従って、この１年間で可能性のある分子をみつけられたため、おおむね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
前述のように、HLA-A2とHLA-A2-H74Lとで異なるバンドを分離し、質量分析を行ってどのタンパク質かを同定する。このバンドが、求める分子シャペロンでなかった場合、HLA-I-ペプチド複合体の他の成分で免疫沈降し、SDS-PAGEの分離パターンを比較する。異なるバンドが見られたら、質量分析でタンパク質を同定する。当初の研究計画では、免疫沈降物を、１次元のSDS-PAGEにかけるのではなく全自動２次元電気泳動装置(Auto2D, SHARP)にかけ２次元的に分離し分離パターンを比較することにしていたが、Auto2Dが予想以上に不安定で少し濃いサンプルをかけるとすぐに止まってしまった。また、質量分析をお願いした会社のプロテオームの専門家から１次元の分離で十分であるとのアドバイスをいただいたので、不安定なAuto2Dは使用しない。タンパク質が同定できれば、CRISPR/Cas9法を使って、その分子シャペロン候補のゲノム遺伝子をノックアウトしたHLA-A2発現細胞株を作製する。同定した分子シャペロン候補は１つに限らない。おそらく複数同定できると考えられるが、それらすべてのノックアウト細胞株ライブラリーを作製する。CRISPR/Cas9法を用いて作製するゲノム遺伝子ノックアウト細胞は、さまざまな遺伝子で作製した経験があるのでさほど困難ではないと予想される。作製した細胞株をターゲットにして、CTLが抗原特異的に認識できるかどうかCTLアッセイで明らかにする。抗原特異的CTLは、HLA-A2 トランスジェニックマウスから作製する。
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| Causes of Carryover |
＜次年度使用額が生じた理由＞
不安定な全自動２次元電気泳動装置を使わない決定をしたことで、これに必要なさまざまな消耗品費用が不要になった。また、HLA-A2とHLA-A2-H74Lとで異なるバンドを見つけるのに予想以上に時間がかかったため、CRISPR/Cas9法を使った実験を行えなかったため。
＜次年度使用額と当該年度助成金を合わせた使用計画＞
質量分析は専門の会社に依頼するが、複数のバンドの質量分析を行う必要があり（１件が10万円前後必要）その費用に使用する。また、CRISPR/Cas9法を使って本格的にさまざまなゲノム遺伝子をノックアウトした細胞株ライブラリーを作製するが、遺伝子工学費用、細胞培養費用、ウェスタンブロットに使用する各種抗体の費用等に使用する。
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Research Products
(4 results)
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[Presentation] Tannic acid affects dopamine receptors, regulates immune responses, and ameliorates experimentally induced colitis.2018
Author(s)
Kawano, M., Saika, K., Takagi, R., Matsui, M., Matsushita, S.
Organizer
第76回日本免疫学会
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