2019 Fiscal Year Research-status Report
Identification of endoplasmic reticulum molecular chaperones to determine antigen presentation to cytotoxic T lymphocytes
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18K06631
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| Research Institution | Saitama Medical University |
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Principal Investigator |
松井 政則 埼玉医科大学, 医学部, 准教授 (50199741)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 細胞傷害性T細胞 / HLAクラスI / 抗原提示 / 分子シャペロン / TAPBPR / 小胞体 / アジュバント |
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| Outline of Annual Research Achievements |
わずか１個のアミノ酸置換を持つHLA-A2変異分子であるHLA-A2-H74Lは、抗原提示に関してHLA-A2と異なる現象を示す。すなわち、小胞体内で自己ペプチドと結合して細胞表面に移動するにもかかわらず、抗原ペプチドとは結合できないためにCTL へ抗原提示できない。一方、新しい分子シャペロン、TAPBPRは、抗原提示の過程において低親和性ペプチドから高親和性ペプチドへと置き換える作用があることから、HLA-A2-H74L分子上で自己ペプチドから抗原ペプチドへ置き換わる際に、TAPBPRがHLA-A2-H74L複合体と正常に結合していないのではないかと考えられた。そこで、GFP融合TAPBPRをHLA-A2発現細胞（C1R-A）とHLA-A2-H74L 発現細胞（C1R-H74L）に発現させ、抗GFP抗体で免疫沈降を行い、SDS-PAGE上で分離パターンを比較し、異なるバンドの質量分析を行ったところ、HLA-A2の一部であることがわかり、分子シャペロンを見つけることはできなかった。
しかし、HLA-A2-H74L分子とTAPBPRにはなんらかの関係があると考えられたため、CRISPR/Cas9法で、C1R-A2細胞のTAPBPRをノックアウトした細胞、C1R-A2-TAPBPR-KOを作製し、C1R-A2-H74L細胞と比較検討することにした。TAPBPRgRNAをCRISPR/Cas9ベクターに挿入し、C1R-A2細胞にトランスフェクションしてクローニングした。増殖したクローンにTAPBPRが発現しているかどうか、Western blotで検出することを試みたが、市販の抗体で良いものがなかった。そこで、RT-PCRによってTAPBPRの発現の有無を確認し、C1R-A2-TAPBPR-KOクローンを作製することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の計画は、FLAGタグ融合HLA-A2またはHLA-A2-H74Lを発現させた細胞株の細胞溶解液を調整し、抗FLAG抗体で免疫沈降して、SDS-PAGEの分離パターンを比較して異なるバンドをみつけだし、質量分析を行うことによって新しい分子シャペロンを同定する予定であった。しかし、その方法では分子シャペロンを同定することができなかった。その後、抗原提示に重要な役割をする新しい分子シャペロン、TAPBPR (Science 358:1060 & 1064, 2017) が発見された。その特性が似ているため、我々の求めている分子シャペロンはTAPBPRであるか、TAPBPRと相互作用している新しい分子シャペロンではないかと考えた。そこで、GFP融合TAPBPR遺伝子をC1R-A2およびC1R-A2-H74Lに発現させ抗GFP抗体で免疫沈降を行い、その分離パターンを比較した。異なるバンドを質量分析したが、分子シャペロンは検出できなかった。
以上の結果から、この未知の分子シャペロンを解析する方法を変更することにした。TAPBPRとはなんらかの関係があると考えられたため、CRISPR/Cas9法で、C1R-A2細胞のTAPBPRをノックアウトしたC1R-A2-TAPBPR-KO細胞を作製し、C1R-A2-H74L細胞と比較検討することにした。TAPBPRが存在しないことをWestern blotで確認しようとしたが、市販の抗体を複数試しても良い抗体がみつからなかったため、予想以上に時間がかかってしまった。しかし、Western blotの代わりにRT-PCRを使うことによって、C1R-A2-TAPBPR-KOクローンを複数作製することに成功した。ただし、解析が遅れているため、「やや遅れている」の区分を選択した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度作製したC1R-A2-TAPBPR-KO細胞とC1R-H74L細胞とのCTLへの抗原提示能をさまざまな角度から検討する。まず、それぞれの細胞表面上で、HLA Class I分子が正常に発現しているかどうかを検討する。そして、内在性に発現させたペプチド（インフルエンザウイルスを細胞に感染させ、インフルエンザタンパク質を内在性に発現させる）、細胞外から加えたペプチドに対して、抗原提示を行うかどうかを検討する。さらに、HLA-A2-H74Lが細胞内でTAPBPRと相互作用しているかどうか、免疫沈降およびSDS-PAGEによって確認する。また、in vivoでの抗原提示能を測定するため、マウス腫瘍細胞株にHLA-A2または、HLA-A2H74Lを発現させ、HLA-A2トランスジェニックマウスに移植し、生体内のCTLが腫瘍細胞を排除するかどうかを検討する。
一方、質量分析による分子シャペロンの同定も再度試みる。FLAGタグ融合HLA-A2またはHLA-A2-H74Lを発現させた細胞株の細胞溶解液から、抗FLAG抗体で免疫沈降して、SDS-PAGEの分離パターンを比較して異なるバンドをみつけだし、質量分析を行う。その際に、さまざまな細胞溶解液を用いて検討する。また、１次元のSDS-PAGEにかけるのではなく全自動２次元電気泳動装置(Auto2D, SHARP)にかけ２次元的に分離し分離パターンを比較することも再度試みる。
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| Causes of Carryover |
＜次年度使用額が生じた理由＞
質量分析を何回か行うはずであったが、１度しか行わなかったため次年度使用が生じた。本年度は、TAPBPR-KO細胞を作製することで時間を使ってしまい、解析する時間がなかったため、その費用の差額が生じた。
＜次年度使用額と当該年度助成金を合わせた使用計画＞
質量分析は会社に依頼するが、１件が10万円前後必でありその費用に使用する。TAPBPR-KO細胞の解析に、さまざまなアッセイを行うため、遺伝子工学費用、細胞培養費用、ウェスタンブロットに使用する各種抗体の費用等に使用する。
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Research Products
(1 results)
