2018 Fiscal Year Research-status Report
Molecular toxicological study on the species differences in activation of nociceptive TRPA1 channel
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18K06641
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| Research Institution | Meijo University |
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Principal Investigator |
神野 透人 名城大学, 薬学部, 教授 (10179096)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
香川 聡子 横浜薬科大学, 薬学部, 教授 (40188313)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | TRPチャネル / 侵害刺激 / 種差 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
TRPA1を介する侵害刺激の受容に関して、ヒトとマウスの種間で差異を生じる要因を明かにする目的で、既に樹立したヒトおよびマウスTRPA1 (hTRPA1およびmTRPA1の安定発現細胞株を用いて、細胞内カルシウム濃度の変化を指標として種差を示す化学物質の探索を行った。VanillinおよびEthyl Vanillinを含む19化合物についてTRPA1活性化能を検討した結果、hTRPA1では14化合物、mTRPA1では12化合物に陽性対照化合物 (Cinnamaldehyde, 500 microM) による応答の50%を超えるTRPA1活性化能が認められた。これらの化合物の中で、Ethyl VanillinおよびVeratraldehydeではヒトとマウスのEC50値の間に約3倍、Methyl 3-(4-Hydroxy-3-methoxy)cinnamateでは約5倍の差異が認められた。
このようなTRPA1活性化能の種差を生じるTRPA1タンパク質の構造上の要因を明らかにする目的で、従来から活性化に関与することが想定されている領域、すなわちN-末のAnkyrin Repeat近傍領域に存在する3つのCysteine (C621、C641、C665) のいずれか、あるいはすべてをSerineに置換したTRPA1変異体安定発現細胞株を樹立した。さらに、TRPA1のリガンド親和性にかかわるとされるTransmembrane Domain 5-6 (TM5-6) について、hTRPA1およびmTRPA1のTM5-6を相互に置換した変異体発現細胞株を樹立する目的で、GeneArtを用いてpEF5/FRT/V5 Constructを作成した。これらのTM5-6置換TRPA1 (hTRPA1/mTM5-6およびmTRPA1/hTM5-6) についてもFlp-In 293細胞を用いて安定発現細胞株を樹立し、3-(4-Hydroxy-3-methoxy)cinnamate 誘導体によるTRPA1活性化の種差に対するTM5-6領域の関与を明らかにする。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
種差の認められる化合物の探索に関しては、期待どおりの成果が得られている。当初の予定では、ヒトおよびマウスTRPA1 TM5-6置換体の安定発現細胞株樹立までを2018年度中に完了することとしていた。したがって、若干の遅延はあるものの、概ね順調に進行しているものと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヒトおよびマウスの間でTRPA1活性化について種差が認められた化合物 (Methyl 3-(4-Hydroxy-3-methoxy)cinnamateなど) について、hTRPA1/mTM5-6置換体およびmTRPA1/hTM5-6置換体を安定発現する細胞株を用いてTRPA1活性化能の変化を検討する。リガンド応答性に関して、mTRPA1のヒト化、あるいはhTRPA1のマウス化が観察された場合には、典型的なTRPA1のリガンドであるMentholとの結合に関与すると考えられているST Domain (TM5に存在) を含む複数の領域に点突然変異を導入して同様の検討を行い、種差の決定的な要因となるアミノ酸を特定する。TM5-6の置換による変化が認められなかった場合には、他のTransmembrane Domainについても置換体を作成し、hTRPA1とmTRPA1の間の活性の変化について検討を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
GeneArtによるTransmembrane Domain置換体の作成が比較的効率的に進展し、試薬・キット等の消耗品費を削減することができたためである。
今後、多数の点突然変異を導入する必要があることから、今年度の差額については、変異導入用Primer、試薬・キット、ならびに細胞培養用試薬等の購入に充当する予定である。
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