2019 Fiscal Year Research-status Report
宿主細胞セラミドからクラミジアスフィンゴミエリンに至るフローの明瞭化と機能解析
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18K06649
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| Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
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Principal Investigator |
熊谷 圭悟 国立感染症研究所, 細胞化学部, 主任研究官 (40443105)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | クラミジア / CERT / セラミド / スフィンゴミエリン合成酵素 / スフィンゴミエリン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、クラミジア感染時に宿主細胞のセラミドが菌体上のスフィンゴミエリンへと至る具体的な流れを明らかにすると共に、その流れがクラミジア感染にどのような意義を有するのか探ることを目的としている。 本研究の解析においては、菌の代謝と宿主細胞の代謝を区別することが重要である。 そのため、CERT欠損HeLa細胞およびスフィンゴミエリン合成酵素欠損HeLa細胞をツールとして用い、これらの細胞にクラミジアを感染させることで各種解析を行なっている。 本年度はCERT欠損HeLa細胞の細胞質に蛍光タンパク質mVenusを発現させ、クラミジア感染時のライブイメージングを撮影した。 通常、封入体膜はmVenusを透過させないため、封入体は丸い影として観察されるが、膜の機能が損なわれるとmVenusの蛍光が封入体の中に観察されるようになる。 この系を用いることで、アポトーシスと封入体膜損傷の前後関係、および、それらの事象の経時的な変化を明らかにした。 詳細は論文発表前の現段階では公にすることができないので、次年度以降に記述したい。 セラミドからSMへの変換については、依然としてクラミジア誘導性のスフィンゴミエリン合成酵素は未同定のままである。 ゲノムデータベースに対する検索も続けているが有望な候補は見つからない。 一方、CERTの各種阻害剤に関する解析をしていたところ、ある種のCERT阻害剤はCERTに対する阻害活性が低いにも関わらず、クラミジアの増殖を強く阻害することが分かってきた。 このCERT阻害剤のCERT以外の作用点を調べていく中で、非常に興味深いことに、クラミジア感染時のセラミドのフローに影響を与えていると考えられる結果が得られてきた。 この結果がフロー解析の突破口になると考えて、現在、詳細について解析を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画案では、CERT欠損HeLa細胞がアポトーシスを起こす様子をタイムラプス観察するために、クラミジア菌体を赤色蛍光タンパク質で標識する、と記述していた。 しかし、実際に実験を行ってみると、封入体膜は極めて高い選択性で細胞質のmVenusを排除していること、現在の設備でも位相差像を見ればなんとか封入体が識別できることが分かり、菌体の標識は必要ないことが分かってきた。 そのため、赤色蛍光タンパク質を発現したクラミジアを作成することなく、当初目標としていた実験結果を得ることができた。 赤色蛍光標識されたクラミジアは更なる先を見据えて引き続き製作を続ける。 タイムラプス解析によって、CERT欠損細胞にクラミジアが感染した時、封入体が維持されたまま細胞がアポトーシスするのか、または、封入体が崩壊することが契機となって細胞がアポトーシスするのか、という研究上の重要な分岐点が確定しつつある。 この結果は、研究計画書で想定していた様々な可能性のうちいくつかについて検討の必要がないことを意味し、最終目標までに必要な労力が大幅に削減された。 クラミジアは宿主細胞のスフィンゴミエリン合成酵素を必要としないこと、スフィンゴミエリン合成酵素を欠損した宿主細胞に感染した時にはクラミジア感染依存的にスフィンゴミエリン合成活性が惹起されることなどを論文として発表した。 クラミジア感染依存的なスフィンゴミエリン合成酵素の本体を突き止めることが難航する中で、CERT阻害剤を使った別のアプローチ方法が浮上してきており、何らかの形でフローの解析を進められる見込みが立ちつつある。 これらの状況を勘案して、概ね順調に推移していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
CERT欠損細胞にクラミジアを感染させた時のアポトーシスの様子をタイムラプスで繰り返し撮影し、結果を確定させる。 また、ほぼCERT非依存的に膜間を移動することができるNBD-セラミドなどを用いて、クラミジア感染時のCERT欠損細胞のアポトーシスをレスキューできるか否か検討する。 ある種のCERT阻害剤が、CERT以外の作用点でセラミドのフローに影響を与えていることが判明してきた。 今後の方針は既に決まっているが、内容を詳細に記述することは論文発表前の現段階では控えたい。 また、引き続きクラミジア誘導性のスフィンゴミエリン酵素を同定するべく候補遺伝子の探索を続ける。
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| Causes of Carryover |
蛍光標識されたクラミジアを作製するために、標準的なクラミジアトラコマティスの株の一つ（為替相場によって変動するものの、通常３０万円以上する）を購入する計画であった。 しかしながら、当該株が米国内でP3に格上げされてしまい、購入に著しい制限が加わったため、これを断念せざるを得なかったため。
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