覚醒剤・麻薬中毒状態における脳内Exosomeの統合オミクス解析

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K06674
• Research Institution: Kobe Gakuin University
• Principal Investigator: 山下 琢矢 神戸学院大学, 薬学部, 助教 (10645203)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: Exosome / 覚醒剤 / 麻薬

Outline of Annual Research Achievements

本研究では覚醒剤・麻薬中毒状態で放出されるExosomeが脳の恒常性に及ぼす影響を統合オミクス(プロテオミクス・リピドミクス・メタボロミクス)解析により明らかにすることを目的とする。本研究で得られた結果は、脳内Exosomeの機能に関する重要な科学的基礎情報となり、将来的にExosomeを活用した新規疾患診断法や治療法の開発に繋がることが期待される。2018年度は乱用薬物を曝露させたヒト神経細胞の基礎物性評価(粒子数測定、Exosomeマーカーの発現解析、粒子径測定、電子顕微鏡解析)を実施した。
ヒト神経芽細胞腫であるSH-SY5Yをレチノイン酸とホルボール12-ミリスタート13-アセタート用いて分化誘導した細胞をヒト神経細胞モデルとして使用した。このヒト神経細胞モデルへ覚醒剤であるamphetamine(AP)、methamphetamine(MA)、ならびに麻薬であるMDMA、MDA、4-methoxy amphetamine(4-MeO AP)、4-methoxy methamphetamine(4-MeO MA)、計6種の乱用薬物(500 μM)を曝露させた。各細胞の培養液からExoquick試薬を用いたポリマー沈殿法によりExosomeを抽出して基礎物性評価を実施した。その結果、粒子数とExosomeマーカーの発現量は全ての化合物曝露群で減少した。中でも4-MeO AP曝露群の粒子数とExosomeマーカーの発現量は他の曝露群と比較して最も減少し、非曝露群の半分以下であった。一方、粒子径や電子顕微鏡観察では非曝露群と曝露群の間で変化は認められなかった。さらに2019年度に予定しているリピドミクス解析の先行実験として、LC-ESI-MS/MSのイオン化条件を最適化した。その結果Exosome由来リン脂質、脂肪酸の良好なクロマトグラムを得ることができた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度予定していた「乱用薬物を曝露させたExosomeの基礎物性評価」をほぼ完遂し、2019年度に実施予定であったオミクス解析に必要な分析条件の最適化を一部終了したため、本研究課題の進捗状況は概ね順調と考えている。

Strategy for Future Research Activity

本年度はExosomeの各オミクス用サンプル前処理とLC-ESI-MS/MS分析条件の最適化をした後に以下のオミクス解析を実行する。

プロテオーム解析：各乱用薬物を曝露した細胞由来Exosomeから得られた蛋白質はLC-ESI-MS/MSを用いたショットガンプロテオーム解析することで変動蛋白質を同定する。

リピドーム・メタボローム解析：メタノールとクロロホルムを使用した一般的な液液抽出法でサンプル前処理し、LC-ESI-MS/MSのMultiple Reaction Monitoringモードで変動分析する。

Causes of Carryover

消耗品納入が締切日に間に合わなかったため。該当の消耗品は2019年度既に納入済み。