2018 Fiscal Year Research-status Report

TMEPAIに対する特殊環状ペプチドを用いたがん治療法、診断法の開発

Research Project

Project/Area Number	18K06682
Research Institution	University of Tsukuba
Principal Investigator	渡邊幸秀筑波大学, 医学医療系, 助教 (40618534)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	特殊環状ペプチド / TMEPAI/PMEPA1 / LDLRAD4 / 抗腫瘍
Outline of Annual Research Achievements	TMEPAIはがんで発現が亢進しているタンパク質で、近年では様々な細胞内シグナル伝達に関わることが示唆されている。また、乳がんや肺がん細胞からTMEPAIをノックアウト、ノックダウンした細胞を樹立すると腫瘍形成が低下することから、TMEPAIはがんの発生・進展にシグナル伝達を介して関わっていると考えられている。そこで、TMEPAIの機能ドメインであるPPxY (PY)モチーフやSmad interaction motif (SIM)に結合し、阻害する特殊環状ペプチドをスクリーニングし、それらの臨床応用を本研究の目的とした。まず、TMEPAIおよび、そのファミリー分子であるLDLRAD4の機能ドメインを含む細胞内領域を組み込んだ発現ベクターを作成し、大腸菌による大量合成を行った。その後、精製を行い、スクリーニングに十分な量のタンパク質を得た。次に、それらのタンパク質を用いて、RaPID (Random non-standard peptide integrated discovery)システムにより、TMEPAIまたはLDLRAD4に結合する特殊環状ペプチドの探索を行った。RaPIDシステムは、非天然アミノ酸を含む、無細胞翻訳システムを用いて翻訳された特殊環状ペプチドと翻訳の元になるmRNAをリンクすることで、ある特定のタンパク質に結合する特殊環状ペプチドの探索、活性種の濃縮、再翻訳を繰り返し行うことで、標的タンパク質に高い結合能力を持つ特殊環状ペプチドを容易に選択する方法である。現在までに、いくつかの候補ペプチドが得られており、得られた特殊環状ペプチドの大量合成、精製を行い、今後、機能を検討する予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason TMEPAIおよびLDLRAD４の機能ドメインを含む細胞内領域をタンパク質発現ベクターに組み込み、大腸菌を用いてタンパク質を発現させ、スクリーニングに十分な量のタンパク質を得た。これらを用いて、特殊環状ペプチドのスクリーニングを行っており、それぞれTMEPAIおよびLDLRAD4に結合する特殊環状ペプチドの候補分子が得られている。TMEPAIとLDLRAD4は機能ドメインであるPYモチーフおよびSIMモチーフを含む細胞内ドメインの相同性が67%であり、両方のタンパク質に結合する特殊環状ペプチドは各機能ドメイン付近に結合する可能性が高く、TMEPAIおよびLDLRAD4の機能を阻害する可能性があると考え、LDLRAD4によるライブラリーの選択を行った後、さらにTMEPAIによる選択を行うことで、両方に結合する特殊環状ペプチドのスクリーニングも行っている。スクリーニングにより同定された特殊環状ペプチドは、ペプチド合成機による大量合成、精製を行っている。合成の際に、蛍光色素等の標識を付加したペプチドも合成しており、現在TMEPAIやLDLRAD4に対する結合性を検討している。さらに、TMEPAIやLDLRAD4は、PYやSIMモチーフを介して、それぞれNEDD4やSmad3などと結合することが知られているため、NanoBitを用いて、それらのタンパク質間結合を測定するためのシステムを構築した。
Strategy for Future Research Activity	今後、得られた特殊環状ペプチドのTMEPAIおよびLDLRAD4への結合性評価、および機能阻害評価を行う。機能評価については、前述したNanoBitを用いたTMEPAIおよびLDLRAD4とパートナー分子とのタンパク質間相互作用を数値化して測定すると共に、TMEPAIはがん細胞においてin vitroのスフェア形成能に関わっていることが知られていることから、TMEPAI発現亢進がん細胞を用いて、スフェア形成能に対する影響を評価する。特殊環状ペプチドは、中分子であるため、膜透過性は担保されていない。スフェア形成能試験の際には、トランスフェクション試薬を用いたり、特殊環状ペプチドの構造を維持したまま、リンカーを介して修飾することにより膜透過性を高める必要がある。また、既に得られているTMEPAIおよびLDLRAD4タンパク質を用いて、構造解析も計画している。特殊環状ペプチドを付加した状態で構造解析を行うことで、特殊環状ペプチドの結合に必要な側鎖が同定されれば、特殊環状ペプチドの最適化を行い、生体内の安定性や膜透過性を高められる可能性があり、さらに類似した構造を持つ化合物などへの発展が見込まれる。In vitroでスフェア形成能の阻害が認められた分子については、がんモデルマウスや腫瘍移植マウスを用いてin vivoでの抗腫瘍評価を行う。