2020 Fiscal Year Research-status Report
Regulatory mechanism of mTOC1 signaling by ubiquitin ligase RNF182 involved in neural differentiation
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18K06685
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
金子 雅幸 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(薬学系), 教授 (10322827)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高田 修治 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, システム発生・再生医学研究部, 部長 (20382856)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | RNF182 / ユビキチンリガーゼ / LAPTM / トランスポーター / ビオチンリガーゼ / RNF183 / ノックイン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では、神経分化時に発現が増加するユビキチンリガーゼRNF182がmTORC1シグナル調節に関与することから、その分子機構を明らかにし、神経の分化におけるRNF182の役割を解明することを目的にしている。今年度は以下のことに取り組んだ。
１）RNF182のユビキチン化基質であるLAPTM4Aが、アミノ酸トランスポーターLAT1以外にどのようなトランスポーターを輸送するか明らかにするため、近位ビオチン標識法によりLAPTM4Aの近傍タンパク質を同定した。その結果、LAT1以外にもアミノ酸トランスポーターや浸透圧調節に働くトランスポーターを同定した。それらに関して、RNF182とその近縁遺伝子RNF183によって分解が促進されるか検討したところ、RNF183のみがLAPTM4Aの結合タンパク質の分解を促進した。このことから、RNF182はLAPTM4Aのユビキチン化により、LAPTM4Aと結合するトランスポーターを安定化するのに対し、RNF183はトランスポーターの分解を促進することが示唆された。RNF182とRNF182はLAPTM4Aを介して、トランスポーターの局在と分解を調節していると考えられる。
２）RNF182の生理的基質を同定するため、ビオチンリガーゼ（BioID2）をRNF182遺伝子にゲノム編集によりノックインすることにした。tdTomatoとBioID-3×FLAG-RNF182との間をT2A配列でタンデムにつなぐことで、tdTomatoとBioID-3×FLAG-RNF182を別々に発現させるドナーベクターを構築した。この方法により組織抽出物から直接RNF182の近傍タンパク質をpull downし、質量分析を行うだけでなく、tdTomatoの蛍光を用いてBioID-3×FLAG-RNF182を発現した細胞をセルソーターで分離することができる。まずはPITCh法により、細胞レベルでノックインできるか検討中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究代表者が令和2年10月より現在の長崎大学に異動したため、研究室の立ち上げに時間を要したことにより研究課題の遂行に遅れが生じた。
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| Strategy for Future Research Activity |
PITCh法による細胞へのノックインの検証まで行う予定である。
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| Causes of Carryover |
研究代表者の異動により研究の遅延が生じたため。残額は次年度に人件費として支出予定である。
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