2019 Fiscal Year Research-status Report

腸管マクロファージのIL-10産生亢進作用をもつ炎症性腸疾患の新たな治療薬の開発

Research Project

Project/Area Number	18K06698
Research Institution	University of Toyama
Principal Investigator	林周作富山大学, 学術研究部薬学・和漢系, 助教 (10548217)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	炎症性腸疾患 / 長期寛解維持 / 腸管マクロファージ / IL-10 / ベルベリン
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、炎症性腸疾患（IBD）の治療において長期の寛解維持を可能とさせる有用な新規治療薬を開発することを目的とし、探索研究から見出した化合物ベルベリンの有効性の検証を前年度に引き続き行った。前年度に実施した研究から、ベルベリンが効率良くマクロファージのIL-10産生を亢進する条件を決定した。さらに、ベルベリンの投与がマウスの腸管組織においてIL-10レベルを上昇させ、IBD病態モデルの病的変化を改善することを見出した。今年度は、ベルベリンが、IBDにおける長期寛解維持の実現に有効であることを検証するため、これまで報告されていないIBD再燃モデルの作製を試みた。IBD再燃モデルはデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）の反復投与によって作製し、DSSの非投与期間における回復期（寛解期に相当）にのみベルベリンを投与し、DSSの再投与によって認められる病的変化（再燃に相当）について溶媒投与群と比較した、ベルベリンは、IBD再燃モデルにおける体重減少を有意に抑制し、下痢および下血の大腸炎症状を抑制する傾向を示した。また、大腸炎症状と相関する大腸丈の短縮を有意に抑制した。さらに、Drug Affinity Responsive Target Stability（DARTS）法を用い、ベルベリンがマクロファージのIL-10産生を亢進するメカニズムを解明する研究を開始した。すなわち、DARTS法によって、ベルベリンがマクロファージにおいて直接に結合するタンパク質の同定を試みた。骨髄細胞由来マクロファージ（BMDM）の細胞溶解物をプロテアーゼ処理したサンプルを電気泳動で分離後、銀染色を行い、タンパク質の発現を検出した。ベルベリン処置したBMDMのサンプルにおいて特異的に検出されるタンパク質が認められ、このタンパク質がベルベリンと直接に結合することが示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 炎症性腸疾患（IBD）の治療において再燃させず長期の寛解を維持することが注目されているが、残念ながら、候補薬物を評価するための適切な動物モデルは報告されていない。そこで、IBDにおける長期寛解維持の実現に有効と考えるベルベリンの作用を検証するため、IBD再燃モデルの作製に挑戦した。まだ予備検討の段階であるが、ベルベリンがIBDにおいて再燃を予防し、長期の寛解維持を実現させる可能性を示すデータを得ることが出来た。一方、ベルベリンがマクロファージのIL-10産生を亢進するメカニズムの解明、in vitro損傷修復モデルにおけるベルベリンの効果に関する研究は着手し始めた段階である。以上のことから、当初の計画よりやや遅れていると判断した。
Strategy for Future Research Activity	腸管マクロファージのIL-10産生を亢進させる作用をもつ炎症性腸疾患（IBD）に対する新規治療薬の開発研究を達成する為に、今後以下の研究を行う予定である。ベルベリンが、IBDにおける長期寛解維持の実現に有効であることを証明するため、引き続きIBD再燃モデルの作製を行い、ベルベリンの効果を検証する。ベルベリンがマクロファージのIL-10産生を亢進するメカニズムに関しては以下の手順で進める予定である。まず、DARTS法により検出されたベルベリンがマクロファージにおいて直接に結合するタンパク質の同定を、電気泳動により得られたゲル断片を質量分析（nanoLC-MS/MS）で解析し、試みる。さらに、同定したベルベリンの標的タンパク質のIL-10産生における役割について遺伝学的、生化学的、分子生物学的および薬理学的手法を駆使して明らかにする。さらに、シングルセルRNAシークエンスを行い、ベルベリンがマクロファージのIL-10産生を亢進するメカニズムについて網羅的に解析する予定である。また、マクロファージと大腸上皮細胞との共培養系を確立し、ベルベリンで刺激されたマクロファージが、IL-10の産生亢進を介して大腸上皮細胞の損傷修復を促進するかについて解析する。
Causes of Carryover	研究代表者がアメリカ合衆国にて国際共同研究中のため、次年度使用額が生じた。また、次年度にシングルセルRNAシークエンス解析を実施する計画をたてており、本解析を行うために高額な物品費が必要であるため、翌年度分として請求した助成金と合わせて使用する予定である。