2018 Fiscal Year Research-status Report
代謝性活性酸素種による黒質アストログリア細胞活性化機構の解明とその制御物質の同定
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18K06702
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| Research Institution | Fukushima Medical University |
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Principal Investigator |
小椋 正人 福島県立医科大学, 医学部, 講師 (10548978)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 活性酸素種 / ミトコンドリア / プロテオーム / アポトーシス / シグナル伝達 / アストログリア細胞 / 神経変性疾患 / 質量分析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
酸化的リン酸化によるエネルギー産生はミトコンドリアの最も重要な機能であるが、同時に、ミトコンドリアはROSの主な発生源である。代謝に伴うROS発生については、神経変性疾患をはじめとする種々の加齢性疾患の発症要因の一つとされている。ところが、ROS発生から疾患の発症に至るまでの一連の分子メカニズムには、未だ未解明な点が多く残されており、解決すべき基本課題となっている。申請者はこれまでミトコンドリアc-Srcによる呼吸鎖複合体IIのsuccinate dehydrogenase A (SDHA)サブユニットの215番目のチロシンリン酸化がROS産生の抑制に必須の役割を持つことを見出してきた。本研究では、アストログリア細胞群特異的SDHAY215F変異体発現トランスジェニック(Tg)マウスを用いて、ミトコンドリア活性酸素種(ROS)に起因するアストログリア細胞活性化モデルを構築し、疾患発症に関与する新規分子の同定および機能解析を行うことを目的とした。本年度は、アストログリア細胞群特異的SDHAY215F変異体発現Tgマウスの作出と病態モデルの表現型解析を行った。Cre/ｌoxPシステムを用いてアストログリア細胞群特異的SDHAY215F発現Tgマウスを作出するために、CAT-SDHAY215F発現Tgマウスとアルデヒド脱水素酵素1L1（Aldh1l1）プロモーターを持つCre発現マウスを交配させた。Tgマウス脳におけるSDHAY215F変異体発現をウエスタンブロット法により確認した。さらに、アストログリア細胞活性化部位を含む脳切片を作製し、神経細胞死を免疫染色法により確認した。同領域からサンプルを調製し、LC/MS/MS法により変動するタンパク質を解析を行い、複数の新規疾患候補分子を同定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究実施計画に従い、研究目的であるアストログリア細胞群特異的SDHAY215F変異体発現Tgマウスの作出と表現系解析を行った。CAT-SDHAY215F発現Tgマウスとアルデヒド脱水素酵素1L1（Aldh1l1）プロモーターを持つCre発現マウスを交配させた後、生まれた産仔をSDHAおよびCreに特異的なプライマーを用いたPCR法により遺伝子型を解析した。その結果、雌雄においてアストログリア細胞群特異的SDHAY215F発現Tgマウスを得ることが出来た。SDHAY215F発現を確認する目的で、脳を摘出し、タンパク質サンプルを調製した後、特異的な抗体を用いたウエスタンブロット解析を行った。アストログリア細胞群特異的SDHAY215F発現Tgマウスのサンプルでは、約70kDaの位置にシグナルが観察された。さらに、発現部位切片を作製した後、TUNEL染色を行ったところ、陽性細胞がコントロール群と比較して、有意に増加していた。さらに、この病変部からタンパク質サンプルを回収し、LC/MS/MS解析を行い、複数の発現変動するタンパク質群を同定した。このため、おおむね計画通りに研究実施がなされている。一方で、Tgマウス個体数の確保に時間がかかり行動解析が遅延している。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、Tgマウス個体数を確保し、行動解析を遂行する予定である。さらに、同定された病態発症により変動する新規疾患候補分子群の機能解析を行う予定である。文献やデータベース情報を基に、新規性を有する分子を選別する。また、レンチウイルスおよびsiRNAシステムを使って分子機能をin vitro（初代培養アストログリア細胞）およびin vivo（脳内接種）で検証する。これらの研究から、ミトコンドリア活性酸素種により開始されるシグナル系の解明を通して、アストログリア細胞活性化と神経細胞死の分子メカニズムの全貌に迫り、神経変性疾患をはじめとする加齢性病態とミトコンドリア活性酸素種との関連性を考察する。
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| Causes of Carryover |
行動解析のためのマウス個体数の確保が達成できず、余剰金が少し生じた。次年度において、合わせて解析し使用する予定である。
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Research Products
(2 results)
