2018 Fiscal Year Research-status Report
Comprehensive elucidation of the biosynthetic pathway of arzanol to establish its microbial production platform
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18K06715
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
田浦 太志 富山大学, 大学院医学薬学研究部(薬学), 准教授 (00301341)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | アルザノール / カレープラント / 生合成 / プレニル転移酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではカレープラントが生産する薬理活性成分アルザノールの生合成経路を網羅的に解明することを目的としている。アルザノールは特徴的なプレニル化ポリケチド二量体であり、1)ポリケチド生成、2)プレニル化および、3)酸化的カップリングの三段階で生成すると推察される。私は既にポリケチド合成酵素を同定しており、本年度はプレニル転移酵素に関する研究を検討した。
まず始めに若葉トランスクリプトームデータをスクリーニングし、候補配列HiPTを確認した。本酵素のcDNAを発現ベクターpPICZAに組込み、酵母Pichia pastorisに導入して発現誘導の後、得られたミクロソーム画分を粗酵素としてアッセイを行なった。この結果、組換えHiPTはphloroacetophenoneにDMAPP由来のdimethylallyl基を転移し、アルザノール生合成前駆体のprenylated phloroacetophenone（2,4,6-Trihydroxy-3-(3,3-dimethylallyl)acetophenone）を生成することを確認した。次いで各種の芳香族及びプレニル基質を用いて基質特異性を検討した結果、本酵素の基質特異性は極めて厳密で、phloroacetophenone及びDMAPP以外の基質を受容しないことを確認した。以上からHiPTはアルザノール生合成経路に特化したプレニル転移酵素と結論した。
アルザノール生合成経路の最終ステップはprenylated phloroacetophenoneともう一分子のポリケチド（6-ethytl-4-hydroxy-3,5-dimethyl-2- pyrone）の分子間酸化カップリングと推察しており、トランスクリプトームデータのスクリーニングから、本反応に関わる酸化酵素の候補配列を数種確認し、今後これらの酵素機能を確認する計画としている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度はアルザノールの生合成経路で機能するプレニル転移酵素の同定及び機能解析に成功し、またトランスクリプトームデータのスクリーニングから最終ステップを触媒する酸化酵素の候補遺伝子を確認した。以上より当初の目標をほぼ達成することができたと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究では先に述べた通り、アルザノール生合成経路のポリケチド合成酵素とプレニル転移酵素を同定、キャラクタライズするに至っており、今後は酸化カップリング酵素の同定を中心に研究を進める。アルザノール生合成経路に予想される酸化カップリング酵素はポリケチド分子間のメチレンを介した炭素-炭素結合を形成すると想定しているが、このような分子間酸化反応を触媒する酵素は植物二次代謝では新規である。一方、分子内でのメチレンブリッジ形成を触媒する酵素としてFAD結合型オキシダーゼの一種であるベルベリン架橋酵素（BBE）が知られており、アルザノール生合成においてもBBE関連酵素がポリケチドの分子間カップリングを触媒する可能性を考えている。そこで今後は、トランスクリプトーム解析で確認したBBE関連配列について酵母で発現し、酵素活性を確認する計画である。また本計画により目的酵素をコードする遺伝子が得られなかった場合には、cDNA発現ライブラリーの作製及び組換え酵素の網羅的な機能解析に基づく機能発現スクリーニングを検討し、アルザノールの生合成に関わる酸化カップリング酵素遺伝子を同定する。
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| Causes of Carryover |
本年度はプレニル転移酵素の機能解析を中心とする実験が比較的順調に進行したことから若干の未使用額が生じた。今後は酸化カップリング酵素の同定に関し、多くの候補遺伝子の機能解析が必要であることから未使用額と翌年度請求額を合わせて適切に使用することで実験の成功につなげる計画である。
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