2019 Fiscal Year Research-status Report

糸状菌由来ジオキシゲナーゼの機能拡張による化合物の創出

Research Project

Project/Area Number	18K06720
Research Institution	Musashino University
Principal Investigator	橋元誠武蔵野大学, 薬学部, 講師 (80552893)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	生合成 / 糸状菌 / 二次代謝産物 / ジオキシゲナーゼ
Outline of Annual Research Achievements	研究実績の概要糸状菌Aspergillus japonicus MF275が生産するhimeic acidの生合成研究において、推定生合成中間体であるテトラミン酸を4-ピロンに環拡張する反応を触媒すると予想されるジオキシゲナーゼHimGを見出している。昨年度、HimGの基質供給のため麹菌による基質供給を試みたが、目的とするテトラミン酸中間体の検出には至らなかった。今年度は、中間体生成に関与するhimAとhimHを導入した酵母形質転換体の代謝物を分析した。酵母を宿主とした場合、スプライシングが起こらないので、遺伝子予測ツールで予想された遺伝子領域をPCRで増幅後、増幅させた遺伝子断片を連結する方法でエクソンのみの遺伝子断片を作製した。酵母発現用プラスミドを用いて酵母に遺伝子を導入し形質転換体を作製し、代謝物の比較を行った。その結果、導入していない酵母と比較して代謝物に差がないことから、生成物が不安定である可能性が考慮された。そこでhimAとhimHに加えて、himGとシトクロムP450のhimC（+シトクロムP450還元酵素）を導入した酵母形質転換体を作成して代謝物を調べたが、himeic acidや新たな生成物を確認することはできなかった。このことから、いずれかのタンパク質が正常に機能していないことが考えられた。次にエクソンのみの遺伝子を用いて麹菌用発現プラスミドに連結し、麹菌で発現を試みた。形質転換体の取得数が少ないため、代謝物の解析には至っていない。形質転換の条件検討を進めている。また、himeic acidの構造類縁体であるpestalamideの生合成に関与する遺伝子のクローニングを試みた。遺伝子長が12kbと長く、また増幅可能なPCR試薬が限られているため、正しい配列のクローニングには至っていない。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason HimGの機能を明らかにするため、HimGの基質と予想されるテトラミン酸の供給を試みている。宿主を昨年度の麹菌から酵母に変更し、中間体生成に関与するhimAとhimHを導入した酵母形質転換体を作製した。その後本形質転換体の培養抽出物を分析した結果、遺伝子を導入していない酵母と比較して代謝プロファイルの差を確認できないことから、生成物が不安定である可能性が考慮された。そこで、himAとhimHに加え、himeic acid生産に必要な残りの遺伝子himCとhimC（+シトクロムP450還元酵素）を導入し、安定な生成物として検出することで、himAとhimHが機能しているかを確認できるかを検討した。5遺伝子を導入した形質転換体の代謝物を遺伝子していない形質転換体と比較した結果、新しい生成物を確認できなかった。酵母で発現したタンパク質が正常に機能しない可能性を考え、麹菌の発現系を再度検討した。麹菌は外来遺伝子をスプライシングできることから、イントロンを含む遺伝子を導入していたが、スプライシングが正常に起きていない可能性を考え、エクソンのみの遺伝子を発現プラスミドに導入した。himA遺伝子が11.5kbと長く不安定なためか、形質転換体の取得数が少ないため、代謝物の解析には至っていない。形質転換に用いるプラスミド量や、反応時間等の条件検討を進めている。
Strategy for Future Research Activity	エクソンのみのhimAとhimH遺伝子を含む発現プラスミドで形質転換した麹菌を作成する。形質転換体作成と同時に他の遺伝子についてもエクソンのみの遺伝子を麹菌発現用プラスミドにクローニングする。前年度の酵母と同様にHimA+HもしくはHimA+HimH+HimG+HimCをもつ麹菌形質転換体を作製し、代謝物を解析する。 HimGはペナム骨格からセフェム骨格へ環拡張反応をするdeacetoxycepharosporin C 合成酵素を鋳型に、モデリングソフトを用いて構造を予測し、活性に重要なアミノ酸残基を推察する。HimGの活性に重要なアミノ酸が予測できた場合、野生型himGと変異型HimGの活性の比較を行う。 pestalamide生合成に関与するPKS-NRPS遺伝子は、複数回に分けてクローニングすることを考えている。
Causes of Carryover	前年度に予定していた発現タンパクの活性が確認できなかったことから、予定していた試薬の購入を控えていた。今年度にタンパクの活性が確認できれば、予定試薬を購入を行う。また、遺伝子のクローニングや点変異が必要になった場合クローニング試薬を購入する。