糸状菌由来ジオキシゲナーゼの機能拡張による化合物の創出

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K06720
• Research Institution: Musashino University
• Principal Investigator: 橋元 誠 武蔵野大学, 薬学部, 講師 (80552893)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 生合成 / 糸状菌 / 二次代謝産物 / ジオキシゲナーゼ

Outline of Annual Research Achievements

糸状菌Aspergillus japonicus MF275が生産するhimeic acidの生合成研究において、生合成遺伝子に関与する遺伝子クラスターを同定している。現在、のところ、HimAとHimHによるテトラミン酸中間体が生成された後、HimGによりテトラミン酸から4-ピロンへの環拡張反応が起こり、最後にHimCにより側鎖が酸化されると予想している。テトラミン酸の環拡張反応の解明を目指すため、ジオキシゲナーゼと相同性を示すHimGについて解析を進めている。一昨年度よりHimGの推定基質と考えられるテトラミン酸について、麹菌および酵母形質転換体を用いて供給を試みており、HimAとHimHを導入した形質転換体の作製を進めている。エクソンのみの遺伝子を用いて麹菌用発現プラスミドを再構築し、麹菌での発現を試みた。HimAの遺伝子が11.5 kbと長いこと、形質転換体の取得数が少ないこと、検討回数が少ない等のため、テトラミン酸中間体を生産する麹菌形質転換体の作製には現在のところ至っていない。
基質の供給と並行して、HimGおよびHimCのモデリング解析を行った。HimクラスターにはジオキシゲナーゼであるhimGとともにシトクロムP450と相同性を持つhimCが存在する。HimCの相同性検索から、HimCによる環拡張も示唆されたため、PDBに登録されているジオキシゲナーゼ（HimGと相同性）およびシトクロムP450（HimC）について計算化学ソフトを利用した立体構造の予測から、モデリング解析を進めている。
基質の供給が達成できていないことから、真の基質ではないものの、市販のテトラミン酸類縁体を購入してin vitro解析を行う予定である。また、酵母に配列を最適化した人工遺伝子を購入し、酵母形質転換体培養物にテトラミン酸類縁体を添加して、基質の変換により、活性の評価を検討する。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

HimGの推定基質と考えられるテトラミン酸について、麹菌および酵母形質転換体を用いて供給を試みている。今年度はエクソンのみの遺伝子を用いて麹菌用発現プラスミドを再構築し、麹菌での発現を試みた。HimAの遺伝子が11.5 kbと長いこと、形質転換体の取得数が少ないこと、検討回数が少ない等のため、テトラミン酸中間体を生産する麹菌形質転換体の作製には現在のところ至っていない。基質の供給が困難であるため、当初予定していたin vitro活性試験には至っていない。
himeic acidの構造類縁体であるpestalamideの生合成に関与する遺伝子のクローニングを試みた。遺伝子長が12kbと長く、また増幅可能なPCR試薬が限ら
れているため、正しい配列のクローニングには至っていないが、試行回数を重ねていくことで目的配列の取得を目指している。
基質の供給と並行して、HimGおよびHimCのモデリング解析を行った。PDBに登録されている5Y7Tは2-オキソグルタル酸依存ジオキシゲナーゼと相同性を示し、リガンドとして基質と2-オキソグルタル酸、鉄イオンを含むので、HimGの鋳型配列とした。6L8Hはカロテノイドの酸化に関与するシトクロムP450であり、リガンドとして基質とプロとポルフィリンIXを含むため、HimCの鋳型配列とした。いずれも30%程度の相同性をもつので、反応ポケット周辺のアミノ酸残基について調査を進めている。

Strategy for Future Research Activity

基質の供給が達成できていないことから、真の基質ではないものの、市販のテトラミン酸類縁体を購入してin vitro解析を行う予定である。また、酵母に配列を最適化した人工遺伝子を購入し、酵母形質転換体培養物にテトラミン酸類縁体を添加して、基質の変換により、活性の評価を検討する。また、モデリング解析に基づいた重要なアミノ酸残基についても調査を予定している。

Causes of Carryover

本来はR2年度までの予定であったが、感染症対策により予定を十分進めることが難しい状況が続いたことから、1年間の延長を申請した。R3年度は繰越金43万のうち、人工遺伝子と配列解析費（その他の項目に該当）として23万円、消耗品費として18万円（物品費）、学会参加費として2.5万円を旅費として予定している。