2018 Fiscal Year Research-status Report

構造生物学を基盤としたマルバタバコのベルベリンブリッジ酵素様蛋白質の網羅的解析

Research Project

Project/Area Number	18K06731
Research Institution	Kyushu University
Principal Investigator	森元聡九州大学, 薬学研究院, 教授 (60191045)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	マルバタバコ / ベルベリンブリッジ様蛋白質 / フェニルプロパノイド / 生合成 / リグニン
Outline of Annual Research Achievements	当該度は、マルバタバコよりベルベリンブリッジ様タンパク質の遺伝子aをクローニングして、カイコを用いた発現系を構築した。コニフェリルアルコールを基質として酵素活性を測定した結果、コニフェリルアルコールをコニフェリルアルデヒドを経由してフェルラ酸まで酸化することを確認した。また、p‐クマリルアルコールを用いて同様の実験を行った結果、p‐クマリルアルデヒドやp‐クマル酸に酸化することが明らかとなった。これらの酵素活性は、酵素を精製直後より1週間4℃で保存した方が増強されることを確認した。また、　コニフェリルアルコールを基質とした場合には、上記化合物以外に2種の未知化合物の生成が確認された。このうち1種についてはHPLCで分取を行うことにより精製に成功したが、収量が低いことから、構造決定には至らなかった。現在、大量の酵素の発現を行っており、ラージスケールで酵素反応を行い。未知化合物の構造を明らかにする予定である。このほか、ベルベリンブリッジ様タンパク質のアイソザイムとしてベルベリンブリッジ様タンパク質ｂ、ｄの遺伝子クローニングおよび発現系の構築に成功している。これらの組換え酵素の活性を測定した結果、ベルベリンブリッジ様タンパク質aと類似した活性を有することが明らかとなった。さらに、当該年度は、カイコで発現したベルベリンブリッジ様タンパク質aの効率の良い精製法の検討を行った。イオン交換樹脂やアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより、精製を試みたが、活性を保った酵素を調製することができなかった。この問題を解決するために、さらに種々のクロマトを用いて精製法を検討している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当該年度では、マルバタバコからクローニングした3種のベルベリンブリッジ様タンパク質遺伝子の発現系を構築し、反応性の特徴を解明することを計画していた。実際に、3種のベルベリンブリッジ様タンパク質をカイコで発現させることに成功している。一方、当初の計画であった、ベルベリンブリッジ様タンパク質の変異体の作成については、現在検討中である。しかしながら、当該年度では酵素反応の特徴を検討した結果、第1級アルコールをアルデヒドやカルボキシルに酸化するという活性を有することを確認したのみならず、未知の化合物の生成を触媒することを明らかにするなど、新規な知見を得ている。以上の研究進捗状況を考慮して、申請課題はおおむね順調に進展していると判断した。
Strategy for Future Research Activity	本年度では、発現した組換え酵素反応により新たに生成した未知化合物の構造を明らかにする。このためにラージスケールで酵素発現、酵素反応を行い、HPLCを用いて精製を行う。次いで、精製した酵素反応物をNMRや質量分析を行うことにより構造を決定する予定である。構造を決定次第、酵素反応メカニズムの解析を行う計画である。また、酵素反応機構に関する情報を得るために、クローニングしたベルベリンブリッジ様タンパク質遺伝子に部位特異的変異を導入する。変異型酵素については野生型酵素と同様カイコを用いたシステムで発現し、活性を測定する計画である。導入した変異と酵素活性の変化を考察することにより、活性アミノ酸の同定を行う。さらに発現した組換えベルベリンブリッジ様タンパク質を高純度に精製した後、結晶化を試みる。できるだけ多くの条件を検討するために、結晶化スクリーニングキットおよび自動分注器を使用する予定である。結晶が得られ次第、Spring-8で回折実験を行う計画である。これにより分解能の高い反射データを得ることができた場合には、分子置換による位相決定、電子密度の計算、精密化を行い、ベルベリンブリッジ様タンパク質の結晶構造を明らかにする。